烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

史艳梅，魏 攀，陈媛媛，杨 冉，金立锋，刘萍萍，李 锋，屈凌波,4，林福呈，王 燃*

1．郑州大学化学与分子工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100号 450001

2．中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

3．中原工学院理学院，河南省新郑市龙湖镇淮河路1号 451191

4．河南工业大学化学化工学院，郑州高新技术产业开发区莲花街100号 450001

烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析

史艳梅*1,2，魏 攀*2，陈媛媛3，杨 冉1，金立锋2，刘萍萍2，李 锋2，屈凌波1,4，林福呈2，王 燃**2

1．郑州大学化学与分子工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道100号 450001

2．中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

3．中原工学院理学院，河南省新郑市龙湖镇淮河路1号 451191

4．河南工业大学化学化工学院，郑州高新技术产业开发区莲花街100号 450001

为揭示烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶（ZDS）基因的功能，采用同源克隆的方法从普通烟草（Nicotianatabacum）中克隆了NtZDS基因，并进行了遗传进化分析。同时通过荧光定量PCR技术分析NtZDS的时空表达模式、利用烟草脆裂病毒诱导的基因沉默（VIGS）体系抑制本氏烟草中ZDS基因的表达，在该基因沉默后再通过定量PCR技术分析NtZDS上下游基因的表达量变化，并检测了烟株色素含量的变化。结果显示：NtZDS基因在普通烟草中至少存在两个同源拷贝，其编码序列与番茄、马铃薯的ZDS基因相似度高于90%。NtZDS在烟草盛花期的叶和花中表达量最高。与对照比较，该基因沉默后，烟株新生叶片出现严重白化现象，能够为VIGS体系提供一个良好的候选报告基因；同时类胡萝卜素合成通路其他基因的表达量和烟株类胡萝卜素、叶绿素含量都显著降低，表明ZDS基因在烟草生长发育及类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。

烟草；ζ-胡萝卜素脱氢酶；基因；克隆；表达模式；病毒诱导的基因沉默

在高等植物中，类胡萝卜素主要存在于叶片的叶绿体及花和果实中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用产生的叶绿素自由基方面具有重要的作用［1］。同时，类胡萝卜素是植物激素脱落酸（ABA）的前体物，可促进ABA的生物合成，增强植物的各种抗逆反应能力［2］。因此，对类胡萝卜素的生物合成进行研究具有重要意义。

ζ-胡萝卜素脱氢酶（ζ-Carotene desaturase，ZDS）是类胡萝卜素生物合成过程中的关键酶之一，主要参与植物体内线状类胡萝卜素的生物合成。ZDS基因目前已从无花果、小麦、番木瓜、辣椒、拟南芥、番茄、草莓、甘薯、黄瓜、柿子和黄水仙等植物中分离出来，其cDNA全长1.8～2.lkbp，编码558～574个氨基酸［3-5］。胡重怡等［6］从栽培烟草韭菜坪2号中克隆出ZDS的cDNA全长序列，并对其编码蛋白的一级、二级结构进行了预测。表达枸杞和龙胆ZDS基因的转基因烟草花中β-胡萝卜素含量提高49%，叶片中的提高91%［7］，说明ZDS基因与类胡萝卜素的合成密切相关。Rodrigo等［8］在柑橘中对类胡萝卜素合成相关基因进行表达模式分析，发现ZDS基因和八氢番茄红素合成酶（PSY）基因表达量上调，有利于线性类胡萝卜素的合成，对柑橘果实颜色形成有重要贡献。综上所述，在多种植物中ZDS基因与类胡萝卜素的合成紧密相关。然而烟草中类胡萝卜素是一种重要的显色物质和香味前体物，与烟叶的外观色泽和感官品质关系密切［9］，在烟叶成熟及烘烤过程中对改善烟叶香气品质和保持香气风格具有重要作用［10］。但烟草中ZDS是否对类胡萝卜素的合成有重要影响尚未见报道。因此，克隆了普通烟草ZDS基因的编码区序列，并分析了该基因的时空表达模式，同时研究了ZDS基因下调情况下对烟草植株的生长发育及代谢物的影响，旨在明确烟草ZDS基因在类胡萝卜素通路中的作用，为选育优良烟草品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

用于表达模式分析的普通烟草红花大金元（红大）种植于云南省玉溪市研和镇大田，分别采集苗床期、伸根期、旺长期、现蕾期、盛花期和不打顶移栽后70 d的烟草叶片、茎秆、须根和花。本氏烟草由郑州烟草研究院国家烟草基因研究中心于温室中栽培，栽培条件为温度（23±1）℃，光照16 h，黑暗8 h，光暗交替，相对湿度（60±2）%［11］。

RNA反转录试剂，克隆载体试剂盒pMDR19-T Simple Vector，大肠杆菌感受态细胞DH5α，DL2 000 DNA Marker，DL10 000 DNA Marker，SolutionⅠ连接酶及各种限制性内切酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。RNA提取和DNA纯化试剂盒及SYBR Green荧光染料购自德国QIAGEN公司。PCR试剂购自北京全式金生物技术有限公司。由生工生物工程（上海）股份有限公司进行引物合成并测序。

1.2 方法

1.2.1 烟草RNA的获取

取普通烟草和本氏烟草植物组织样品，用液氮研磨成粉，按照RNA提取试剂盒说明书步骤进行RNA提取，经Agilent2100检测RNA的完整性，-80℃保存备用。

1.2.2 引物设计

根据NCBI网站普通烟草序列（KC484705.1）设计ZDS基因上下游引物，上游引物ZDS-F为5’-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3’，下游引物ZDS-R为5’-TCAGACAAGACTCAACTCATCA GATAC-3’。将克隆得到的红大ZDS编码区序列与其他物种的进行比对，找出保守区域，利用保守区域设计病毒诱导ZDS基因沉默引物，上游引物ZDS-VIGS-F为5’-ATGGATCCATCCTGTCGCATA TGCTCTTGGA-3’（包含KpnⅠ酶切位点），下游引物为5’-CACTCGAGGAGGCATGTAAGGGTCACC AGGT-3’（包含XhoⅠ酶切位点）。ZDS基因沉默后定量PCR检测引物序列见表1中ZDS-Q-F和ZDS-Q-R。

表1 类胡萝卜素通路定量PCR所用引物及序列

1.2.3 ZDS基因编码区全长的克隆

根据反转录试剂盒说明书将烟草RNA反转录成cDNA作为模板，体系20μL，其中：RNA模板1μg，5×反转录缓冲液4μL，dNT Ps（10mmol/L）4μL，RNA酶抑制剂20U，Oligo（dT）18引物50pmol，AMV反转录酶10U，用DEPC处理过的水加至20μL，然后用ZDS基因的特异性引物进行扩增。PCR反应体系及反应条件见表2和表3。PCR结束后，纯化PCR产物，纯化后DNA片段连接T载体，然后转化DH5α感受态，在LB/Amp/IPTG/X-gal平板上进行筛选培养，挑取白色单菌做菌落PCR验证，选2～3个阳性菌进行测序。

1.2.4 遗传进化分析

用邻接法（Neighbor-joiningmethod）和MEGA 5.0软件对植物的ZDS核苷酸序列构建系统进化树，进化树中的数字代表计算频率值，重复检验1 000次。

1.2.5 TRV2-ZDS重组载体的构建和农杆菌转化

以克隆出的ZDS1基因为模板，用病毒诱导基因沉默引物扩增保守区域，PCR反应条件如表3（延伸时间为35 s），PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收。回收的ZDSVIGS目的片段和pTRV2（pYL156）载体均使用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ进行双酶切，反应体系：PCR回收产物（或pTRV2载体）2μg，KpnⅠ（10 U/μL）和XhoⅠ（10 U/ μL）各2.5μL，10×Buffer 5μL，加水至50μL。37℃酶切4 h后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收纯化双酶切产物，并连接转化。菌落PCR验证得到阳性菌，提取质粒，用KpnⅠ和XhoⅠ对质粒进行双酶切验证并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

表2 PCR反应体系

表3 PCR反应条件

将构建成功的质粒通过液氮冻融法转化农杆菌GV3101。分别取pTRV1、pTRV2、pTRV-ZDS和pTRV-PDS质粒1μL，加入含0.1m L的GV 3101农杆菌感受态细胞的EP管中，冰上放置30m in；将含有该质粒的农杆菌感受态细胞放入液氮速冻1min，然后37℃温育5m in；加入900μL LB液体培养基，28℃悬浮振荡培养3 h；5 000 r/min离心1m in，弃去上清液，加入200μL LB液体培养基，重悬沉淀；取200μL重悬液（即转化产物）均匀地涂于含25μg/m L利福平和50μg/m L卡那霉素的LB平板上，28℃培养2～3 d；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后，摇菌注射本氏烟草的烟苗。

1.2.6 农杆菌侵染

利用注射接种的方法进行农杆菌侵染［11］，分别将pTRV1、pTRV2、pTRV2-ZDS和pTRV2-PDS阳性菌接种于含相应抗生素的5m L LB培养基中，28℃恒温培养箱中振荡培养过夜。吸出0.2m L菌液接种于20mL LB培养基［含10 mmol/L 2-N-吗啉基乙磺酸（MES）和20μmol/L乙酰丁香酮（AS）］中，28℃过夜培养。离心（4 000 r/min，30 s）收集上述菌体，然后重悬在LB培养基（含10mmol/L MgCl2+10 mmol/L MES+200μmol/L AS）中，调OD600为1.0，室温静置3 h。以不注射为空白对照，pTRV1&pTRV2为阴性对照（TRV），pTRV1& pTRV2-PDS为阳性对照（TRV-PDS），pTRV1& pTRV2-ZDS为实验组（TRV-ZDS），每组中两种菌液按1∶1比例混合，分别注射烟草。

1.2.7 荧光定量PCR

利用SYBR Green染料法在普通烟草中定量分析ZDS基因的时空表达模式，同时分析农杆菌侵染本氏烟草后类胡萝卜素合成相关基因的表达量差异，采用26SrRNA为内参基因。荧光定量PCR体系为：1μL cDNA模板（50 ng/μL），10μL SYBR Green染料（2×SYBR Green），ZDS（或26S）基因上下游引物各1μL（5μmol/L），无RNA酶的水7μL。PCR反应条件采用两步法：94℃5m in；94℃20 s，60℃20 s，40个循环；4℃，停止。

PSY、PDS和CRTISO等与类胡萝卜素合成相关的基因表达量分析所用的引物见表1，荧光定量PCR体系和条件同1.2.3节的ZDS基因。选取代表性的3株烟草样品进行分析，每个样品重复检测3次，取Cp值的平均值，用2-△△CT法计算。

1.2.8 烟草色素含量测定

称取干燥烟草叶片样品200mg，25m L 90%丙酮超声萃取20min，过滤取上清液，液相色谱检测烟草色素含量（质量分数）。色谱条件：色谱柱为反相C18液相色谱柱，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为3.9mm×150mm，4µm粒径，或相当型号色谱柱。进样量：10µL，流速：0.5m L/min。检测波长：448 nm和428 nm。流动相A：异丙醇。流动相B：80%乙腈水溶液。

1.2.9 统计学分析

采用SPSS 19.0软件进行数据处理和单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 NtZDS基因编码区（CDS）的克隆及分析

以ZDS-F和ZDS-R为引物，从cDNA模板中PCR扩增ZDS基因的CDS序列，PCR产物电泳结果显示在1 000～2 000 bp之间出现较亮的特异条带，见图1。纯化目的片段，连接T载体，进行阳性克隆验证，大量挑取阳性菌进行随机测序。结果发现两条相似度为96.02%的NtZDS基因序列，一条序列CDS全长为1 785 bp（命名为NtZDS1），另一条CDS全长是1 767 bp（命名为NtZDS2）。序列比对见图2，结果表明普通烟草体内NtZDS基因至少存在两个拷贝。Blast结果显示两条序列与马铃薯和番茄的ZDS基因的相似度均高于90%。

图1 NtZDS编码区序列的PCR电泳图

不同植物ZDS核苷酸序列进化树分析结果见图3。结果表明，NtZDS1和NtZDS2分别与作为父母本烟草的绒毛状烟草和林烟草聚为一支，NtZDS1源于林烟草基因组，NtZDS2源于绒毛状烟草基因组，林烟草和绒毛状烟草杂交加倍的过程中各贡献了1个ZDS基因同源拷贝，因此在栽培烟草体内至少存在有两个拷贝。同时，在ZDS基因进化树中，双子叶植物和单子叶植物（拟南芥除外）各聚为一支，ZDS基因属于双子叶植物的茄科，与同属茄科的番茄、马铃薯聚为一支，表明该基因与茄科植物的亲缘关系很近。

图2 NtZDS1和NtZDS2两序列比对

2.2 NtZDS基因时空表达模式分析

NtZDS基因在栽培烟草红大各个发育时期和各器官中的转录水平表达模式分析见图4。结果显示，NtZDS基因在各个时期的叶片中表达量最高，尤其是嫩叶（第15位叶片），在现蕾期和盛花期叶中表达量达到顶峰，在盛花期烟株花中表达量显著提高，这可能与β-胡萝卜素的积累及花的显色相关。根部的表达量最低，转录水平表达模式的研究结果表明，该基因与植物的生理状态密切相关，在烟株光合作用较强的幼嫩组织中表达量较高，其生物学功能可能与光合生理过程存在密切的关系。

2.3 NtZDS基因VIGS重组载体的构建及验证

ZDS基因在普通烟草体内存在相似度达96.02%的两个拷贝，进行分别的沉默难度大，因此采用VIGS技术对该基因进行共同沉默。以克隆得到的ZDS1编码区基因全长质粒为模板，用ZDS-VIGS-F&-R扩增VIGS片段保守区域，对应于CDS的782～1 414 bp位置上，片段大小为633 bp。琼脂糖凝胶电泳检测与预期大小一致，在600 bp左右有清晰的特异性条带，见图5A。然后经过酶切连接到pTRV2载体上，构建pTRV2-ZDSVIGS载体。对菌落PCR验证阳性菌液进行质粒提取，并进行双酶切（KpnⅠ/XhoⅠ）验证，结果见图5B。在约600 bp处有单一条带出现，初步认为构建成功。然后对该质粒进行测序，结果显示插入片段长度为633 bp，经序列比对与设计片段序列完全吻合，表明pTRV2-ZDS重组载体构建成功。

2.4 农杆菌接种

图3 烟草与其他植物ZDS基因的系统进化树

图4 ZDS基因的时空表达模式分析

图5 琼脂糖凝胶电泳图

八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）常被作为VIGS体系的指示基因，其沉默后植物新叶出现显著的白化现象，以验证TRV载体的侵染效率［12］。分别将转化有重组质粒的农杆菌（TRV/TRV-PDS/ TRV-ZDS）侵染本氏烟草，TRV-PDS菌液注射烟草约10 d左右，烟草新叶出现显著的白化现象，表明TRV病毒诱导基因沉默体系已发挥作用。如图6所示，TRV-PDS农杆菌侵染一个月后植株表型出现严重的光漂白现象。如图7所示，与阴性对照TRV相比，侵染TRV-ZDS的烟株同时也出现了显著的光漂白现象，ZDS基因表达被抑制，新生叶片都显现出严重白化现象，株高明显变矮，长势不强，但不致死，与PDS基因沉默后表型比较相似。

图6 PDS基因沉默表型图

图7 本氏烟草ZDS基因沉默表型图

侵染效率考察结果显示，注射TRV-ZDS农杆菌的20株烟草中，侵染发病率为100%，表型一致，定量PCR检测ZDS转录表达水平仅有对照植株的10%（甚至更低，P＜0.05）（图8），而注射TRV烟株与未注射烟株WT之间无显著性差异（P＞0.05），表明ZDS基因被有效地沉默。由此可见，ZDS基因也可以作为TRV VIGS沉默体系的参照基因，为TRV介导的病毒诱导基因沉默体系提供一个良好的候选参照基因。

图8 ZDS在本氏烟草TRV 介导的病毒诱导基因沉默体系中基因表达量

2.5 ZDS 基因沉默后对类胡萝卜素合成通路及代谢物的影响

TRV-ZDS农杆菌侵染烟株后，利用实时荧光定量PCR检测类胡萝卜素合成通路相关基因转录表达量的变化，结果发现侵染TRV-ZDS烟株，类胡萝卜素合成通路基因的表达量均明显下降（P＜0.05），而注射TRV烟株与未注射WT烟株间无显著差异（P＞0.05），见图9。对代谢物类胡萝卜素及叶绿素含量进行分析发现，β-胡萝卜素、紫黄质、新黄质、黄体素及叶绿素a和b也显著降低（P＜0.05），见图10。说明烟草中ZDS基因表达受抑制后，严重阻碍了植株类胡萝卜素及叶绿素合成，所以ZDS在类胡萝卜素合成中起着重要的作用。

图9 ZDS基因表达抑制后类胡萝卜素合成通路基因表达量分析

图10 ZDS基因表达抑制后类胡萝卜素及色素含量变化

3 结论

从普通烟草红大中扩增出NtZDS基因序列，发现该基因至少存在两个拷贝。该基因在现蕾期、盛花期的叶片和花中表达量较高，推断该基因生物学功能可能与光合生理过程存在密切关系，对烟草花中类胡萝卜素的合成可能具有重要的调控作用。

ZDS基因表达下调后，新生叶片出现严重白化现象，株高明显变矮，长势不强，与PDS基因沉默后表型相似，为TRV介导的病毒诱导基因沉默提供了一个良好的候选参照基因。对沉默植株上下游基因表达量分析及代谢物分析结果都说明ZDS基因在类胡萝卜素合成过程中发挥着重要作用。

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责任编辑 董志坚

Cloning and Functional Analysis ofζ-Carotene Desaturase Gene in Nicotiana tabacum

SHI Yanmei*1,2,WEI Pan*2,CHEN Yuanyuan3,YANG Ran1,JIN Lifeng2,LIU Pingping2,LI Feng2,
QU Lingbo1,4,LIN Fucheng2,and WANG Ran**2
1.College of Chem istry and Molecular Engineering,Zheng zhou University,Zheng zhou 450001,China
2.Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC,Zhengzhou 450001,China
3.College of Science,Zhong yuan University of Technology,Zheng zhou 451191,China
4.College of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zheng zhou 450001,China

To reveal the function ofζ-carotene desaturase（ZDS）inNicotianatabacum（N.tabacum),NtZDSgene was homologously cloned fromN.tabacumand its phylogenetic analysis was conducted. Fluorescence quantitative PCR techno logy was used to analyze the tem poral and spatial expression patterns ofNtZDSand tobacco rattle virus induced gene silencing（VIGS）system was employed to inhibit the expression ofZDSinNicotianabenthamiana.The expression levels of upstream and downstream genes were further analyzed by fluorescence quantitative PCR,and the changes of pigment contents in tobaccoplants were determ ined.The results showed that there existed at least two homologous copies ofNtZDSgene inN.tabacumwith the sim ilarity of more than 90%in coding sequence toZDSgenes in tomato and potato.The expression level ofNtZDSwas the highest in leaves and flowers at flowering stage.Comparing with the control,the leaves of tobacco p lants presented severe bleaching phenotype afterNtZDSsilencing, it provided a good candidate for reporter gene for VIGS system;meanwhile the expression levels of upstream and downstream genes and pigment contents（carotenoid and chlorophy ll）significantly decreased,it implied thatZDSgene played an important role in the course of growth,development and carotenoid formation ofN.tabacum.

Nicotianatabacum；ζ-carotene desaturase；Gene；Cloning；Expression pattern；Virus induced gene silencing（VIGS)

TS413

A

1002-0861（2015）09-0001-08

10.16135/j.issn1002-0861.20150901

2014-08-25

2015-02-28

中国烟草总公司郑州烟草研究院科技项目“烟草类胡萝卜素含量的遗传调控和材料验证”（092013CZ0620）。

史艳梅（1985—），在读博士研究生，研究方向：烟草基因功能研究。E-mail：sym zgh@163.com；*共同第一作者：

魏攀（1983—），博士，工程师，主要从事烟草分子生物学研究。E-mail：weipan83@126.com；**通讯作者：王燃，E-mail：wangranljj2010@163.com

史艳梅，魏攀，陈媛媛，等.烟草ζ-胡萝卜素脱氢酶基因的克隆和功能分析［J］.烟草科技，2015，48（9）：1-8.

SHI Yanmei，WEI Pan，CHEN Yuanyuan，etal.Cloning and functional analysis ofζ-carotene desaturase gene in Nicotiana tabacum［J］.Tobacco Science&Technology，2015，48（9）：1-8.