铜绿假单胞菌对假丝酵母菌的影响

孙安民，王 伟

（河南省开封市中心医院，河南开封475000）

铜绿假单胞菌对假丝酵母菌的影响

孙安民，王 伟

（河南省开封市中心医院，河南开封475000）

目的 研究临床分离的铜绿假单胞菌（PA）对常见假丝酵母菌（包括白色假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌和葡萄牙假丝酵母菌等）的抑制作用。方法 通过革兰染色、菌落形态、氧化酶试验及上机鉴定收集临床上120株PA；通过纸片法检测PA对常见假丝酵母菌的抑制作用，根据对假丝酵母菌有无抑制作用将PA分为抑制性PA和非抑制性PA；利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶法（SDSPAGE）对两组PA进行分泌蛋白电泳，观察电泳条带的差异；利用共同孵育试验观察两组PA对假丝酵母菌菌丝的抑制作用。结果 32株PA为抑制性PA，88株为非抑制性PA；两组PA分泌蛋白凝胶电泳条带明显不同；两组PA与假丝酵母菌共同孵育后菌丝数量明显不同。结论 部分PA对常见假丝酵母菌有抑制作用，其机制可能是通过抑制菌丝生长和分泌某种蛋白质而发挥作用的。

铜绿假单胞菌；假丝酵母菌；纸片法；抑制作用

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0972）

PA在自然界分布广泛，是土壤中存在的最常见的细菌之一。各种水、空气、正常人的皮肤、呼吸道和肠道等处都有PA存在。它是一种条件致病菌，正常情况下一般不致病，当条改变时可引起感染，包括创伤后伤口感染、肺炎、脑膜炎、附睾炎、乳突炎、眼部感染和菌血症等。国内外文献称，在PA感染的病灶中，极少发现假丝酵母菌存在。本实验通过纸片法验证PA对假丝酵母菌的抑制作用，并通过共同孵育试验和SDS－PAGE电泳进一步探讨PA抑制作用的机制。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2012年1月—2013年12月从我院住院及门诊患者送检标本中分离出120株PA，已经剔除了重复菌株，经革兰染色、菌落形态、氧化酶实验和Vitek－2全自动微生物鉴定仪对菌株进行鉴定。大肠埃希菌ATCC23922、肺炎克雷伯菌ATCC700603和铜绿假单胞菌ATCC25923为质控菌株。实验用的假丝酵母菌为标准菌株：白色假丝酵母菌ATCC10231、热带假丝酵母菌ATCC 750、光滑假丝酵母菌ATCC2001、近平滑假丝酵母菌ATCC 22019、克柔假丝酵母菌ATCC 6258、葡萄牙假丝酵母菌ATCC 34449，均由省检验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 纸片法 将PA制成0.5麦氏浊度的菌悬液，吸取3μl均匀涂布于直径6mm圆形滤纸片上，制成PA湿菌片。在沙保罗培养基上涂布2麦氏浊度的真菌菌液，然后贴上PA湿菌片，孵育48h后观察结果。

1.2.2 共同孵育实验 每只无菌EP管中均加入1 ml LB液体培养基，分别将每一株PA 0.5麦氏浊度的菌悬液和每一种假丝酵母菌2麦氏浊度菌悬液各50μl加入EP管中，100r／min离心，30℃摇动孵育24h，取混悬液置显微镜下观察。另取50μL每种假丝酵母菌2麦氏浊度菌悬液加入LB液体培养基中作对照。

1.2.3 SDS－PAGE电泳 将抑制性PA菌株和非抑制性PA菌株作SDS－PAGE分泌蛋白电泳分析。在LB液体培养基中加入0.5麦氏浊度PA菌悬液50μl，150r／min离心，35℃摇动孵育24h，取沉淀煮沸10min后直接进行SDS－PAGE电泳，染色后观察结果。

2 结果

2.1 纸片法结果 在120株PA与6种假丝酵母菌标准菌株纸片法抑菌试验中，32株PA对假丝酵母菌有明显的抑菌环，且对每种假丝酵母菌的抑菌环直径接近，均在16mm－20mm之间，88株PA无抑菌环或抑菌环不明显。质控菌株大肠埃希菌ATCC23922和肺炎克雷伯菌ATCC700603均无抑菌环出现。

2.2 共同孵育实验结果 抑制性PA菌株与假丝酵母菌共培养时，假丝酵母菌菌丝显著减少，甚至不可见，而非抑制性PA菌株与假丝酵母菌共培养时，菌丝数量明显多于抑制性PA菌株共同孵育实验结果，与对照管相近。见图1。

图1 共同孵育实验（普通光学显微镜×400）

2.3 SDS－PAGE分泌蛋白电泳结果 抑制性PA菌株和非抑制性PA菌株电泳条带的共同点是在35 ×103处均有一条深染条带；不同点是非抑制性PA菌株35×103条带附近几乎看不到别的条带，而抑制性PA菌株35×103条带附近还显示几条颜色较淡的条带，分别位于24×103处、27×103处和38× 103处，即抑制性PA菌株要比非抑制性PA菌株多出几个条带。见图2。

图2 SDS－PAGE分泌蛋白电泳

3 讨论

PA是广泛存在于水、土壤、动物体内的一种条件致病菌，人们关注更多的是它的危害性，它可以引起外伤和烧伤创面等多个部位感染，是人类化脓感染中最常见的病原菌之一，仅次于金黄色葡萄球菌；它具有易定植、易变异和多重耐药的特点，是引起医院感染较常见的细菌。其实它对人体致病的同时也表现出积极的一面，它可以抑制或杀死感染病灶中其它病原微生物，特别是真菌。

本实验重点研究PA对于假丝酵母菌的抑制作用，国内外文献已有这方面的报道。Hogan等［1］认为，PA能在白色假丝酵母菌菌丝表面形成一层厚厚的生物被膜，从而杀死白色假丝酵母菌，也就是说PA抑制或杀灭白色假丝酵母菌是通过影响其菌丝的生长而完成的，与孢子无关，因为不同酵母菌的孢子细胞壁存在较大差异；另外，PA的毒力因子（如四型菌毛、吩嗪、磷脂酶C等）也可以抑制或杀死白色假丝酵母菌的菌丝。Kaleli等［2］通过实验证明，PA对白色假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌和热带假丝酵母菌的抑制率在血平板和沙保罗培养基上差异无统计学意义。Grillot等［3］通过PA与假丝酵母菌纯培养及混合培养来调查PA与假丝酵母菌间的相互作用，结果发现所有被测试假丝酵母菌在血平板和细菌过滤液中培养时均受到抑制。徐令清等［4］通过实验得出结论，PA对大多数致病性真菌均有抑制作用，主要通过抑制菌丝生长或分泌性蛋白发挥作用。

根据本实验和以上报道，PA对假丝酵母菌抑制作用机理主要有三方面，一是产生多种毒力因子，包括菌毛、荚膜多糖、内毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶和磷脂酶等，抑制或杀灭假丝酵母菌；二是分泌一种膜状物，影响菌丝的生长；三是分泌多种特殊蛋白质，对假丝酵母菌产生毒害作用。

本实验显示，一部分PA对假丝酵母菌有明显的抑制作用，而另一部分则无抑制作用，与报道部分相符；通过共同培养试验进一步发现，抑制性PA可以通过干扰假丝酵母菌菌丝生长而发挥抑制作用，与Hogan等的研究结果一致；SDS－PAGE蛋白电泳显示，抑制性PA菌株与非抑制性PA菌株的分泌蛋白条带存在明显差异，前者比后者多出2－3个条带，说明抑制性PA分泌一些特殊蛋白质，这些蛋白质可能抑制假丝酵母菌的生长，与徐令清等的报道基本相符。

另外还有一些PA抑制其它真菌的报道，Hughes等［5］研究表明，在囊包性纤维症中超过80%的患者会伴有PA感染，而此疾病很少合并真菌感染，使用广谱抗菌药物和类固醇激素治疗后，大部分PA被杀死，而往往导致烟曲霉和白色假丝酵母菌感染，PA可能对烟曲霉和白色假丝酵母菌有抑制作用。另有报道［69］称，PA可以抑制隐球菌的生长。到目前为止，还没有在囊包性纤维症患者体内分离出隐球菌的报道，隐球菌与PA都是常见的肺部致病菌，如果这二者不能同时定植，那么有可能PA抑制了隐球菌的生长，绿脓菌素可能是抑制囊包性纤维症患者肺部隐球菌感染的主要原因。

综上所述，PA在体内和体外都具有强大的抗假丝酵母菌活性，原因可能是产生绿脓菌素形成生物被膜，抑制假丝酵母菌菌丝生长；或产生多种细胞间因子及分泌某些特殊蛋白质干扰假丝酵母菌的生理代谢而发挥抑制作用。我们将进一步分离和纯化这些物质，做进一步研究。

［1］Hogan DA，Kolter R.Pseudomonas－Candida interactions：An ecological role for virulence factors［J］.Science，2002，296（5576）：2229.

［2］Kaleli I，Cevahir N，Demir M，et al.Anticandidal activityof Pseudomonas aeruginosa strains isolated from clinicalspecimens［J］.Mycoses，2007，50（1）：74.

［3］Grillot R，Portmann－Coffin V，Ambroise－Thomas P.Growth inhibition of pathogenic yeasts by Pseudomonas aeruginosa in vitro：clinical implications in blood cultures［J］.Mycoses，1994，37（9／10）：343.

［4］徐令清，汪 峰，侯红艳，等.铜绿假单胞菌对致病真菌的抑制作用［J］.重庆医学，2014，43（7）：769.

［5］Hughes WT，Kim HK.Mycoflora in cystic fibrosis：some ecologic aspects of Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans［J］.Mycopathol Mycol Appl，1973，50（3）：261.

［6］Rella A，Yang MW，Gruber J，et al.Pseudomonas aeruginosa inhibits the growth of Cryptococcus species.Mycopathologia［J］，2012，173（5－6）：451.

［7］陈 佳，许 东，邢铭友，等.pvdQ基因在铜绿假单胞菌对白假丝酵母菌形态抑制作用中的功能［J］.华中科技大学学报（医学版），2012，41（1）：12.

［8］Caldwell CC，Chen Y，Goetzmann HS，et al.Pseudomonas aeruginosa exotoxin pyocyanin causes cystic fibrosis airway pathogenesis［J］.Am J Pathol，2009，175（6）：2473.

［9］Rella A，Yang MW，Gruber J，et al.Pseudomonas aeruginosa inhibits the growth of cryptococcus species［J］.Mycopathologia，2012，173（5／6）：451.

Effect of Pseudomonas Aeruginosa on Candida

SUN An－min，WANG Wei.（Laboratory Department，Kaifeng Central Hospital，Kaifeng475000，China）

Objective We investigated the inhibitory effects on common Candida（including Candida albicans，Candida tropicalis，Candida glabrata，Candida parapsilosis，Candida krusei and Portugal Candida）from Pseudomonas aeruginosa（PA）isolated from clinics.Methods We collected 120clinical strains of PA by Gram’s stain，bacterial colony morphology，oxidase production and automated microbial identification system.By sterilizing filter paper－disk method we detected the inhibitory effect of PA on common Candida，according to the inhibitory effect of PA on Candida，we set the PA into inhibitory group and non－inhibitory group.Using sodium dodecyl sulfate－polyacrylamide gel electrophoresis（SDS－PAGE），we made secreted protein electrophoresis on two groups，we observed the differences in electrophoresis bands.By Co－cultured test to observe the inhibitory effect of PA in two groups on Candida hyphae.Results 32strains of PA were inhibitory PA，88strains were non inhibitory PA.In the two groups of PA，the gel electrophoresis of protein bands were obviously different，the number of PA was significantly different after incubation with Candida hyphae.Conclusion Some of PA have inhibitory effect on common Candida，its mechanism may play a role by inhibiting the mycelial growth and secrete some proteins.

Pseudomonas Aeruginosa；Candida；Sterilizing filter paper－disk method；Inhibition

R446.5

A

孙安民（1967－），男，副主任检验师，主要从事临床微生物检验。

2014－09－10）

1007－4287（2015）06－0972－03