MCM5在膀胱肿瘤组织和尿脱落细胞中的表达及临床意义

曹冉华，云 升，苏乌云，刘彩霞，赵海燕

（内蒙古医科大学第一附属医院，内蒙古呼和浩特010050）

MCM5在膀胱肿瘤组织和尿脱落细胞中的表达及临床意义

曹冉华，云 升，苏乌云，刘彩霞，赵海燕

（内蒙古医科大学第一附属医院，内蒙古呼和浩特010050）

目的 探讨微小染色体维持蛋白（MCM）在膀胱肿瘤组织和尿脱落细胞中的表达及临床意义。方法 收集本院2012年8月—2013年8月住院患者及健康志愿者的尿脱落细胞或膀胱组织标本，对其进行MCM5检测。结果①膀胱癌患者在不同病理分级、临床分期MCM／β－actin的差异有统计学意义（P＜0.05）；②80例膀胱癌患者尿脱落细胞中有71例MCM5呈阳性表达，与正常对照组和其他泌尿系疾病组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌患者尿脱落细胞MCM5阳性率在各病理分级、临床分期差异无统计学意义（P均＞0.05），但其表达在各病理分级、临床分期差异有统计学意义（P均＜0.05）。③与尿细胞学相比，尿脱落细胞MCM5检测诊断膀胱癌的灵敏度、阴性预测值较高，假阴性率低，差异有统计学意义（P＜0.05），二者的特异度、假阳性率及阳性预测值比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 尿脱落细胞中MCM5检测对膀胱癌诊断意义重大，是对膀胱肿瘤复发检测、预后评价较好的指标，值得广泛应用于临床诊断。

MCM5；膀胱肿瘤；尿脱落细胞；诊断

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0927）

膀胱肿瘤是最常见的泌尿系肿瘤，其恶性程度强、复发率高，且预后差，严重地影响患者的生活质量，甚至威胁着患者的生命安全。对膀胱肿瘤的早期发现、早期诊断是防治本病的关键［1］。许多研究发现，微小染色体维持蛋白（minichromosome maintenance proteins，MCM）可作为肿瘤标志物应用于疾病检测，为此，我们对MCM5在膀胱肿瘤组织和尿脱落细胞中的表达及临床意义进行探讨，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源

尿脱落细胞和膀胱组织标本采自我院2012年8月—2013年8月住院的经术后病理证实为膀胱移行细胞癌患者80例（膀胱癌组），男性48例，女性32例，年龄28－76岁；病理分级：G1 35例，G2 24例，G3 21例；临床分期：Tis－T1 34例，T2－T4 46例；其他泌尿系统疾病患者50例（泌尿系疾病组），男28例，女22例，年龄17－79岁；疾病类型包括尿路感染13例，泌尿系结石15例，输尿管狭窄16例，前列腺增生6例；随机选取20例健康志愿者作为对照组，男12例，女8例，年龄20－75岁。

1.2 标本收集及处理

取术前清晨第2次尿液至少150ml，从中分出1份50ml行尿细胞学检查，剩余尿液做总RNA提取，置于4℃环境下，1 000r／min离心10min后弃上清液，将沉淀物用生理盐水清洗2遍后立即提取。80例膀胱癌患者均留存肿瘤组织标本，并及时置于－80℃冰箱内保存。

1.3 试剂

选用美国Invitrogen公司生产的Trizol试剂，美国Promega公司生产的TaqDNA聚合酶、dNTPs、Reverse Transcription System试剂盒，北京博大科技公司生产的DNA片段玻璃奶回收试剂盒，上海博亚公司合成的Mcn5、β－actin引物。

1.4 检测方法

1.4.1 MCM5的检测 ①提取总RNA：将适量组织置于组织研磨器内，放入1ml Trizol试剂，研磨完全后将其转至1.5ml EP管内；取所获得的尿脱落细胞，放入1ml Trizol试剂，快速抽提并溶于由DEPC处理的双蒸水内，置于－80℃冰箱内保存。②Nested RT－PCR：将1μg总RNA加入50μl反应体系中。过程如下：逆转录45℃，45min，90℃，5 min后，变性，94℃，30s后退火，56℃，50s后延伸，94℃，30s后结束（循环35次），作为第1次PCR。选择首次PCR产物1μl，内引物5’－CAGGGATGAACTCAAGCGGC－3’和5’－CAGGCTACGAATGCTGGAAG－3’各1μl，按照上述过程进行第2次PCR。所生成产物按照20g／L琼脂糖进行电泳，将β－action作为参照物，在同时有MCM5及β－actin目的片段时认为MCM5阳性，在只出现β－actin目的片段时认为阴性。采用英国Syngene公司生产的GENE GENUS凝胶图像分析仪做凝胶图像摄取及灰度值扫描。MCM5相对表达量采用MCM5／β－actin灰度值比表示。

1.4.2 尿细胞学检查 利用HE染色，将脱落细胞悬液100μl置入涂片离心器内，500r／min离心1 min后涂片，略干燥后浸入高浓度酒精固定20min，行苏木素染色后用流动水清洗，然后0.5%氨水蓝化约30s，流动水清洗后置0.5%伊红水30s，流动水清洗后浸入二甲苯，用中性树脂封固读片。将检查结果中的中度核异质、重度核异质及肿瘤细胞认为阳性，通过分析灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值等评价检测尿脱落细胞MCM5诊断膀胱癌的意义。

1.5 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，计量资料比较采用方差检验，计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织标本中MCM5表达与临床病理学特征间的关系

膀胱癌患者在不同病理分级、临床分期的MCM5表达量差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 膀胱癌组织标本中MCM5表达与临床病理学特征间的关系

2.2 尿脱落细胞MCM5表达与临床病理学特征的关系

80例膀胱癌患者尿脱落细胞中有71例MCM5呈阳性表达，各组间比较差异有统计学意义（P＜0.05），膀胱癌患者尿脱落细胞MCM5阳性率在各病理分级与临床分期上差异无统计学意义（P均＞0.05），但其表达量在各病理分级与临床分期上差异有统计学意义（P均＜0.05），见表2。

表2 尿脱落细胞MCM5表达与临床病理学特征的关系

2.3 尿脱落细胞MCM5检测及尿细胞学诊断膀胱癌的效果

尿细胞学检测膀胱癌患者中有36例阳性。与尿细胞学MCM5检测比较，尿脱落细胞MCM5检测诊断膀胱癌的灵敏度、阴性预测值较高，假阴性率较低，差异有统计学意义（P＜0.05），二者在特异度、假阳性率及阳性预测值方面比较则差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 尿脱落细胞MCM5检测与尿细胞学诊断膀胱癌的效果比较 （%）

3 讨论

MCM蛋白家族是由6个亚单位组成的亲水的六聚体复合物，其mRNA水平随着细胞周期而呈周期性变化，于G1后期表达最高，G0期表达最低，其中的MCM5是蛋白家族中具有代表性的亚单位之一。许多学者发现，MCM5不出现于终末分化细胞及静止细胞，只表达于增殖细胞中，被认为是特异性增殖相关因子［2－4］。另有研究发现，MCM5在不典型增生及肿瘤组织中可扩展至上皮全层，而在正常组织中仅表达于上皮基底层的增殖区，基于此，通过检测MCM5蛋白表达即可对是否有肿瘤细胞做出诊断［5－7］。

本研究中，80例膀胱癌患者尿脱落细胞中有71例MCM5呈阳性表达，且膀胱癌患者尿脱落细胞MCM5阳性率随着病理分级及临床分期的增加而升高，与既往研究结果一致。之所以能够通过对尿脱落细胞MCM5检测对膀胱肿瘤做出诊断，主要原因在于膀胱肿瘤细胞属于典型的增殖细胞，不同于正常膀胱表层黏膜细胞所处的静止期状态，膀胱肿瘤细胞在增殖期可形成突入膀胱腔内的乳头，而容易在尿液冲刷下脱落。正如前文所述，MCM5存在于不典型增生及肿瘤组织，故可通过对尿脱落细胞MCM5检测做出膀胱肿瘤的诊断及预后评估［8－10］。在利用凝胶图像半定量对结果分析后发现，MCM5表达量在各病理分级、临床分期上有显著差异，表明通过检测尿脱落细胞中的MCM5有助于判断膀胱癌肿瘤的恶性程度。

另外，本研究通过RT－PCR方法检测尿脱落细胞MCM5诊断膀胱肿瘤的敏感度为88.75%，显著高于尿细胞学检查的45.00%，但特异度、假阳性率和阳性预测值比较差异无统计学意义，与既往研究结果类似。表明尿脱落细胞MCM5检测在诊断膀胱癌方面灵敏度及特异度均较高，相比尿细胞学检查具有较大的优势［11］。

综上所述，尿脱落细胞中MCM5检测对膀胱癌诊断意义较大，是对膀胱肿瘤复发检测、预后评价较好的指标，值得广泛应用于临床诊断。

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Detection of mini chromosome maintenance 5 protein in bladder carcinoma tissue and urine exfoliate cells

CAO Ran－hua，YUN Sheng，SU Wu－yun，et al.（The First Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Hohhot，Inner Mongolia 010050，China）

Objective To explore the expression and clinical significance of tiny chromosome maintenance protein（MCM）in bladder cancer tissue and urine exfoliated cells.Methods Urinary exfoliated cells or tissues of the bladder of hospitalized patients and healthy volunteers in our hospital from August 2012－August 2013were collected，and the urine exfoliated cells or tumor tissue MCM5was tested.Results ①The difference was statistically significant of clinical stagebladder cancer patients in different pathological grading MCM／β－actin（P＜0.05）.②There were 71cases with MCM5positive in 80bladder cancer patients with urinary exfoliated cells，differences between bladder cancer group and Normal control group or other urinary diseases group were statistically significant（P＜0.05）.③compared to urine cytology，sensitivity and negative predictive value of urine exfoliated cells MCM5detection and diagnosis of bladder cancer was significantly higher，false－negative rate was significantly lower，the difference was statistically significant（P＜0.05），There was no statistical significance difference in specific degree，false positive rate and positive predictive value（P＞0.05）.Conclusion Diagnosis of MCM5in urine exfoliated cells to detect bladder cancer have a greater sense，it is a recurrence of bladder cancer detection，prognosis better indicator，it is worth widely used in clinical diagnosis.

MCM5；Bladder tumor；Urine exfoliated cells；diagnosis

R737.14

A

曹冉华（1980－），女，硕士，主治医师，从事实体瘤化疗方面的研究。

2014－04－19）

1007－4287（2015）06－0927－03