肝细胞癌患者血浆循环DNA的定量分析及临床意义

冉贵萍，黄 海，杨国珍＊，郭 鹏，袁 勇

（1.贵阳医学院检验系，贵州贵阳550004；2.上海奉贤区奉城医院，上海201411）

肝细胞癌患者血浆循环DNA的定量分析及临床意义

冉贵萍1，2，黄 海1，杨国珍1＊，郭 鹏2，袁 勇2

（1.贵阳医学院检验系，贵州贵阳550004；2.上海奉贤区奉城医院，上海201411）

目的 定量检测肝细胞癌（HCC）患者血浆循环DNA（cf－DNA）含量，探讨其在原发性肝癌早期诊断及病情监测中的临床应用价值。方法 收集40例肝细胞癌、30例代偿期肝硬化、20例活动性肝炎和25例正常健康对照血浆，提取血浆循环DNA，采用real－time实时荧光定量PCR方法检测β－actin基因的表达，确定血浆循环DNA的水平。结果 HCC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组中位血浆循环DNA浓度分别为17.090ng／ml、8.182ng／ml、7.447 ng／ml和9.014ng／ml，HCC组和健康对照组循环DNA水平比较有显著性差异（P＜0.05）；肝硬化组、肝炎组和健康对照组比较无显著性差异（P＞0.05），ROC曲线分析表明血浆循环DNA水平能够区分肝癌和健康人（AUC＝0.8450），以循环DNA水平11.92ng／ml作为诊断HCC的临界值，其诊断的特异度是84.0%，敏感度是72.5%。血浆cf－DNA浓度与AFP联合检测可以将HCC诊断率提高至77.5%。结论 real time PCR技术可精确定量血浆循环DNA浓度，检测血浆中循环DNA含量可作为诊断和监测原发性肝癌指标的有效补充。

肝细胞癌；循环DNA；实时荧光定量PCR

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0918）

早期诊断是原发性肝癌获得早期治疗的前提，肝癌有强大的代偿能力，早期常无症状，这给肝癌的早期诊断带来一定的困难，因此，寻找外周血肿瘤标记是临床上亟需解决的一个难题。另外，对肝癌术后患者复发进行有效监测也是控制肝癌，提高生存率的关键［1－3］。循环无细胞DNA（circulating cellfree DNA，cf－DNA）是存在于血清和血浆中的游离DNA，近年研究表明［4－7］，肿瘤在生长过程中持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液，因此，检测血清或血浆的循环DNA含量的变化，可反映肿瘤的存在和严重程度，同时循环DNA检测具有微创性，标本获取方便，价格低廉等优点，因此肿瘤循环DNA的研究可为肿瘤标志物开辟一片广阔前景。本研究旨在通过对健康人群、肝炎、肝硬化及HCC病人血浆中循环DNA浓度的测定，探讨血浆中循环DNA的检测在原发性肝癌早期诊断中的意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 40例肝细胞癌（HCC）均为住院病例，其中男性29例，女性11例，年龄38－65岁，中位年龄58岁。全部病例均经病理组织学诊断为原发性肝癌，其中AFP≥400μg／L的22例。30例肝硬化患者组，其中男性18例，女性12例，年龄36－79岁，中位年龄65岁。20例肝炎患者组，其中男性12例，女性8例，年龄35－75岁，中位年龄62岁。25例健康对照血浆来自健康体检者，男性15例，女性10例，年龄35－72岁，中位年龄60岁。四组资料在年龄及性别上比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 标本采集 所有HCC病例均于入院后次日留取静脉血标本，全部标本经低温离心机4℃3 000 rpm离心15min后分离血浆，以每管800μl分装置－20℃保存备用。相同方法采集保存50例肝脏良性疾病、25例健康体检者血浆。

1.3 实验方法

1.3.1 血浆DNA的抽提和纯化 血浆DNA的抽提采用血液DNA快速提取试剂盒（深圳亚能公司），对其中的操作步骤适当改良（按比例扩大每次处理的血浆量，DNA得率和纯度无影响），每300μl血浆获得80μl的DNA，所有保存血浆标本均采用同一批号的试剂盒抽提DNA以减少批间误差并统一集中检测。

1.3.2 血浆DNA定量 采用ABI7500进行实时荧光定量PCR分析。β肌动蛋白（β－actin）扩增引物序列为：正向引物5’－AAGGTGACAGCAGTCGGTTGGA－3’，反向引物5’－GAGAAGTGGGGTTTTAGGA－3’，扩增产物为156bp。正常人白细胞基因组DNA用NanoDrop ND－1000定量，再用easy solution溶液（Takara）梯度稀释（250、50、10、2）ng／ml后作为标准品构建标准曲线，对待测样品进行定量。PCR扩增反应体系的总体积为20μl，包括7.2μl蒸馏水，10μl SYBR GreenⅠ，0.4μl的上游引物和0.4μl的下游引物，2μl模板。反应条件为：95℃1m，1个循环，95℃10s，60℃30s，35个循环，95℃1s，65℃持续收集。

1.4 统计学处理

全部资料用SPSS 17.0软件分析，采用非参数检验比较不同组间血浆DNA水平的差异，统计学显著性水平为P＜0.05，ROC曲线评估采用GraphPad Prism（V5.0，GraphPad Software）进行分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组病例的血浆循环DNA的浓度与健康对照组循环DNA浓度的比较 原发性肝癌组血浆循环DNA水平中位值为17.090ng／ml（7.870－48.010 ng／ml），明显高于健康对照组9.014ng／ml（2.664－25.820ng／ml）（P＜0.05）；肝硬化组血浆循环DNA水平中位值为8.182ng／ml（2.464－40.360 ng／ml），和健康对照组的血浆循环DNA浓度比较无明显差异（P＞0.05）；肝炎组血浆循环DNA平均浓度为7.447ng／ml（3.086－38.710ng／ml），和健康对照组的血浆循环DNA浓度比较无明显差异（P＞0.05）。（见表1）

表1 HCC组、肝硬化组、肝炎组和健康对照组血浆DNA含量比较

2.2 ROC曲线分析用于评价血浆循环DNA浓度的检测对于诊断肝癌的价值 如图1所示，肝癌组与健康对照组的血浆循环DNA浓度进行比较，AUC值（0.8450）大于0.5，统计学表明血浆循环DNA水平可作为辅助诊断肝癌的指标（P＜0.05），以血浆循环DNA浓度11.92ng／ml作为诊断HCC的临界值，其诊断特异度为84.0%，敏感度达72.5%。而肝硬化组与健康对照组比较的AUC值为0.6212，略高于0.5，统计学比较表明不足以将两者区分开（P＝0.1920），肝炎组与健康对照组比较的AUC值为0.6667，统计学比较表明不足以将两者区分开（P＝0.0833）。

2.3 联合血浆循环DNA的检测和AFP的检测两项指标对肝癌早期诊断的意义 2001年9月全国肝癌学术会议确定将AFP≥400μg／L作为HCC临床诊断的阳性阈值［8］。在本研究中，HCC组中有22例AFP≥400μg／L，单独用AFP指标对HCC的诊断率为55%，在18例AFP＜400μg／L的患者中，有9例患者血浆循环DNA浓度增高超过临界值，因此，联合两项指标可将肝癌的诊断率提高至77.5%（31／40）。

图1 ROC曲线分析

3 讨论

循环DNA是存在于血清和血浆中的游离DNA，近年来日益增多的研究表明，肿瘤在生长过程中能持续释放肿瘤细胞DNA进入外周血液，循环DNA能维持和表达肿瘤细胞来源的分子遗传特性，因此通过检测血浆循环DNA的总量可以反映肿瘤的存在和严重程度。2006年，逄锦忠［9］等报道，HCC患者血浆循环DNA与肿瘤组织微卫星变异有较高的一致性变化，血浆循环DNA可以用来反映肿瘤组织的微卫星变异。2008年，Catherine［10］等报道，血浆中结肠癌特异性甲基化DNA可用于结肠癌的筛查。2009年，Eric［11］等通过熔解曲线分析技术对外周血甲基化DNA进行定量，用以诊断肿瘤。2012年，蒋叶［12］等人动态监测急性髓系白血病（AML）患者血浆循环DNA的含量，结果发现AML患者组血浆DNA含量显著高于对照组，血浆DNA定量检测对AML的化疗疗效判断和复发监测具有重要意义。因此，外周血循环DNA定量可能成为一种新的肿瘤诊断及预后判断的标志物。本研究主要通过检测肝癌患者外周血循环DNA的含量变化，探讨外周血循环DNA水平作为肝癌早期诊断指标的可行性，实验中通过定量检测健康人、慢性活动性肝炎、肝硬化及肝癌患者血浆循环DNA浓度，结果显示肝炎组、肝硬化组血浆循环DNA浓度与健康组比较无统计学差异，而肝癌组DNA含量较健康组高，具有统计学差异（P＜0.05）。ROC曲线分析表明，血浆循环DNA定量对肝癌具有较高诊断价值（AUC＝0.8450），当最佳临界值（CUTOFF值）为11.92ng／ml时，敏感性为72.5%，特异性为84.0%，因此，外周血循环DNA水平对肝癌的诊断有一定价值。

目前临床上原发性肝癌常用的辅助诊断和监测的血清学指标是AFP，然而AFP的灵敏度有限，AFP诊断原发性肝癌的阳性率为55%－65%［13，14］。本组实验在AFP阳性（≥400μg／L）检测的22例患者中，20例患者血浆循环DNA浓度大于CUTOFF值11.92μg／L，在AFP阴性（＜400μg／L）检测的18例患者中有9例患者血浆循环DNA浓度大于CUTOFF值，可以看出血浆循环DNA浓度检测比传统的血清蛋白肿瘤标志物的检测更灵敏，更有利于肿瘤的早期诊断。另外，在有些病例中，循环核酸的水平随着成功的抗癌治疗而下降，这提示循环中游离DNA可以被用来监测疾病的进展。由于所获得病例数有限，对肝癌患者进行血浆循环DNA定量检测可能用于抗癌疗效监测还有待进一步研究。

以循环DNA为基础的核酸分析，具有取材容易、微创伤性等特点，并适合动态检测，避免了采集癌组织作为标本来源的困难，因此，在肿瘤筛查方面极具前景，但由于血浆循环DNA并不具有HCC的特性，因此联合检测血浆循环DNA含量和血浆循环DNA中HCC特异性基因改变如甲基化、SNP等可能是将来这一领域的主要研究方向，有望为肝癌的早期诊断、预后监测提供更加敏感、特异的指标。

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Quantitative analysis of circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma and its clinical signif－icance

RAN Gui－ping1，2，HUANG Hai1，YANG Guo－zhen1，et al.（1.Guiyang Medical College，Guiyang550004，China；2.Shanghai Fengcheng Hospital，Shanghai 201411，China）

Objective To quantify the circulating DNA level in plasma from patients with hepatocellular carcinoma（HCC），and to explore its significance for early diagnosis in HCC patients.Methods Blood samples were collected from 40HCC patients，30patients with liver cirrhosis，20patients with chronic active hepatitis and 25healthy controls.Circulating DNA in plasma was extracted and quantified by detecting theβ－actin gene through real－time quantitative PCR method.Results The median values of plasma circulating DNA concentration among the HCC group，cirrhosis group，hepatitis group and healthy control group were 17.090ng／ml，8.182ng／ml，7.447ng／ml and 9.014ng／ml respectively.There is significant difference between the HCC group and healthy control（P＜0.05）and no significant difference between the cirrhosis group and healthy control（P＞0.05），no significant difference between the hepatitis group and healthy control（P＞0.05）.Receiver operating characteristic（ROC）analysis demonstrated that the circulating DNA level could be used to distinguish HCC from healthy control（AUC＝0.8450）with sensitivity of 72.5%and specificity of 84.0%at the cut－off value of 11.92ng／ml.The combined analysis of using both plasma circulating DNA level and AFP revealed an elevated detection rate of 77.5%.Conclusion The detection of plasma circulating DNA level can be an effective supplement index for the diagnosis of HCC.

Hepatocellular carcinoma；Circulating DNA；real－time PCR

R735.7

A

冉贵萍，女，42岁，硕士，副主任技师，研究方向：肿瘤分子诊断。

2014－10－15）

1007－4287（2015）06－0918－04

国家级教学团队（教高函［2009］18号）

＊通讯作者