阿尔茨海默病大鼠模型中胰岛素样生长因子－1和Caspase－3蛋白表达的情况观察

王 璇，吴成吉，董淑欣，王志群

（佳木斯大学附属第一医院神经四科，黑龙江佳木斯154000）

阿尔茨海默病大鼠模型中胰岛素样生长因子－1和Caspase－3蛋白表达的情况观察

王 璇，吴成吉，董淑欣，王志群＊

（佳木斯大学附属第一医院神经四科，黑龙江佳木斯154000）

目的 观察阿尔茨海默病大鼠模型中胰岛素样生长因子－1和caspase－3蛋白表达情况。方法 90只体重范围在（240±10g）的健康Wister大鼠，随机分为三组：观察组（β—淀粉蛋白建模大鼠）、对照组（生理盐水对照）和正常组，每组30只。用放射免疫法测定各组大鼠脑组织中的胰岛素样生长因子－1（IGF－1），western blot法检测各组Caspase－3蛋白的表达情况。结果 观察组、对照组和正常组脑组织中IGF－1蛋白表达水平分别为［（0.87±0.14）μIU／ml、（2.59±0.27）μIU／ml、（2.67±0.24）μIU／ml］，对照组、正常组的实验结果与观察组相比差异显著（P＜0.05）；观察组、对照组和正常组大鼠脑组织中caspase－3蛋白表达水平分别为［（69.72±11.39）μIU／ml，（31.22± 6.98）μIU／ml，（32.53±7.26）μIU／ml］，对照组和正常组的实验结果与观察组相比具有显著差异（P＜0.05）。结论阿尔茨海默病模型大鼠脑组织中的IGF－1蛋白表达减少，Caspase－3蛋白表达增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表达在阿尔茨海默病大鼠中呈负相关。

阿尔茨海默病；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

（Chin J Lab Diagn，2015，19：0874）

阿尔茨海默病是一种以大脑皮质和海马区出现老年斑，神经原纤维缠结，神经元细胞突触损伤或消失，神经组织中异常的炎症和氧化应激反应为特点，造成患者进行性认知障碍的中枢神经系统退行性疾病［1］。Bassil研究发现阿尔茨、海默病的发生与Aβ的异常堆积密切相关，细胞周期相关细胞因子异常表达，引起神经元的损伤和丢失，导致患者的认知功能进行性减退［2］。本次实验着重研究阿尔茨海默病大鼠模型中胰岛素样生长因子－1和Caspase－3蛋白的表达情况，以从分子水平研究阿尔茨海默病的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 由佳木斯大学动物实验室提供的90只体重范围在（240±10g）日龄45d的正常的Wister大鼠，随机分为3组，每组30只，分别为观察组、对照组和正常组。

1.2 方法

1.2.1 建模方法［3］无菌条件下，各组大鼠经腹腔注射10%水合氯醛麻醉。观察组海马内注射凝聚态Aβ1－40 4μl，针头停留3min后缓慢撤针，封闭进针口防止溶液弥出，缝合伤口并局部使用抗生素防止感染；对照组向海马内缓缓注入4μl生理盐水，其他操作均与观察组相同；正常组大鼠不做任何处理。各组大鼠均在正常条件下培养。

1.2.2 评价认知和学习能力［5］Morris水迷宫实验是一种通过检测大鼠的空间感和方向感来评价大鼠的学习记忆能力的实验。水迷宫根据东南西北分为1，2，3，4四个象限，安全平台随机固定于某一象限的某个位置，水面超过安全平台1cm，水温在20－22℃范围内，一共实验5天。每天分别将大鼠从四个不同入水点面对池壁置入水中，记录其找到安全平台的时间（潜伏期）。若其在2min内找不到安全平台，则人为牵引至安全平台，在平台上停留20s再放回笼中，此时潜伏期计作120s。取平均值。水迷宫实验5d后进行跳台实验。跳台实验是通过检测大鼠对电击的反应来评价大鼠的学习记忆能力的实验。将大鼠置入反应箱中5min熟悉环境后接通电击电源，大鼠正常情况下会条件反射的寻找安全跳台以躲避电击。通过记录大鼠首次跳上安全跳台的时间（反应时间）和在5min内从跳台上错误跳下的次数（基础错误次数）；24h后重复操作，记录第一次跳下跳台的时间（潜伏期）和5min内错误跳下的次数（错误次数）作为评级其学习记忆能力的指标。

1.2.3 实验方法 造模成功后，正常培养各组大鼠5天，在无菌条件下将各组小鼠断头取脑，一部分脑组织制成脑匀浆，用免放法检测脑匀浆中IGF－1蛋白表达情况；另一部分脑组织在RIPA蛋白裂解液中提取总蛋白，用免疫印迹法检测Caspase－3蛋白的表达情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS 16.5软件对所有实验所得数据进行处理，对计数资料用χ2检验，对计量资料用t检验；并进行线性相关性分析。

2 结果

2.1 大鼠的行为学改变 Morris水迷宫实验结果，观察组、对照组和正常组的潜伏期分别为39.89 s、11.06s、10.23s；观察组的潜伏期明显长于正常组和对照组，差异显著（P＜0.05）；正常组和盐水组的差别较小，不具有统计学意义（P＞0.05）。跳台实验结果，观察组较正常组和对照组相比，反应时间延长，基础错误次数增多，潜伏期短，错误次数多，有显著差异；正常组和盐水组的差别较小，不具有统计学意义（表1）。

表1 跳台实验结果

2.2 IGF－1蛋白表达结果 观察组、对照组和正常组的IGF－1蛋白表达水平分别为（0.87±0.14）μIU／L、（2.67±0.24）μIU／L、（2.59±0.27）μIU／L。观察组与正常组和对照组相比，脑匀浆中的IGF－1蛋白表达水平明显减少，差异显著（P＜0.01）；正常组和盐水组相比，差异较小（P＞0.05）。

2.3 Caspase－3蛋白表达结果 观察组、对照组和正常组中Caspase－3蛋白表达水平分别为（69.72± 11.39）μg／ml、（31.22±6.98）μg／ml、（32.53± 7.26）μg／ml。观察组与正常组和对照组组相比，脑组织中Caspase－3蛋白表达明显增多，差异显著（P＜0.01）；正常组和盐水组相比，差异较小（P＞0.05）。

2.4 IGF－1蛋白表达和Caspase－3蛋白的相关性利用Spearman相关性分析对IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表达的相关性进行检验，结果发现，观察组IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表达呈负相关（r＝－0.52，P＜0.01）。

3 讨论

阿尔茨海默病是一种常见于老年人的，以大脑皮层和海马区出现异常的老年斑，神经突触的破坏，神经原纤维的缠结，神经元的坏死和丢失为特点的中枢神经系统退行性疾病造成患者的进行性认知障碍，学习能力和记忆能力下降。然而阿尔茨海默病的发生机制并不十分明确，普遍接受的观点认为其可能与凋亡性细胞因子的过度活化有关。研究表明，阿尔茨海默病的发病主要与神经元当中的β－淀粉蛋白的异常表达有关，促进凋亡性细胞周期相关细胞因子的表达，导致神经组织的炎症反应和氧化应激反应，造成神经细胞的损伤和死亡［6］。本次实验通过观察β－淀粉蛋白诱导的阿尔茨海默病大鼠模型脑组织中的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白的表达的变化，有助于揭示阿尔茨海默病的发病机制，有利于寻找临床治疗阿尔茨海默病的有效方法。

β－淀粉蛋白有神经毒性，其在神经组织中的异常堆积可以造成以影响神经突触延长，减少神经细胞间的成网，神经细胞迁移能减弱为特征的神经细胞结构和功能的损伤，Chommanart的研究表明，β－淀粉蛋白诱导的大鼠模型可以较好的模拟阿尔茨海默病的发病过程［7］。因此本次实验使用的造模方法产生的实验结果对阿尔茨海默病有较好的还原性。

IGF－1蛋白是一种调控神经干细胞增殖分化，神经细胞的能量代谢，突触的延长，神经组织的修复，广泛参与神经系统的许多功能调节，具有调节学习和记忆功能的细胞因子，并且其表达水平随年龄的增加而减少［8］。所以IGF－1蛋白的异常降低可能与阿尔茨海默病的发病有关［9］。本次实验中观察组大鼠脑组织中的IGF－1蛋白表达水平与其他两组相比下降，大鼠的学习记忆能力下降，这提示IGF－1蛋白表达水平下降会促进阿尔茨海默病的发生。

Caspase－3蛋白一种重要的细胞凋亡蛋白，可以通过级联反应介导细胞的凋亡［10］。Caspase－3蛋白的异常活化与神经细胞的凋亡有关。本次实验中观察到，观察组大鼠脑组织中Caspase－3蛋白表达相对于其他两组增多，这提示该蛋白在脑组织中的表达增加会加重大鼠脑组织神经细胞的凋亡，造成大鼠的神经功能异常，学习记忆认知能力下降，与阿尔茨海默病的发生密切相关。

通过对阿尔茨海默病大鼠模型的IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表达水平的观察可以进一步揭示AD的发病机制，为AD的治疗提供新的方向，有利于从基因水平和分子水平研究AD的有效治疗途径。

综上，阿尔茨海默病大鼠模型中胰岛素样生长因子－1蛋白表达下降，Caspase－3蛋白表达增加；IGF－1蛋白和Caspase－3蛋白表达呈负相关。

［1］Munetsugu Hara，Yoshihiro Nishi，Yushiro Yamashita，et al.Relation between circulating levels of GH，IGF－1，ghrelin and somatic growth in Rett syndrome［J］.Brain and Development，2013，11（15）：1469.

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［3］何玉梅，邢 影，刘俊孚，等.CRP联合IL－6检测在轻度认知功能障碍患者血清中的变化及临床意义［J］.中国实验诊断学，2012，16（7）：1307.

［4］Sourav Sikdar，Avinaba Mukherjee，Samrat Ghosh，et al.Condurango glycoside－rich components stimulate DNA damage－induced cell cycle arrest and ROS－mediated caspase－3dependent apoptosis through inhibition of cell－proliferation in lung cancer，in vitro and in vivo［J］.Environmental Toxicology and Pharmacology，2014，37（1）：689.

［5］Gurupadaswamy HD，Thirusangu P，Vijay Avin BR，et al.DAO－9（2，5－di（4－aryloylaryloxymethyl）－1，3，4－oxadiazole）exhibits p53 induced apoptogenesis through caspase－3mediated endonuclease activity in murine carcinoma［J］.Biomedicine ＆Pharmacotherapy，2014，6（8）：390.

［6］朱清远，王玉发，顾加祥，等.hIGF－1转基因促周围神经再生和抑制肌肉萎缩的实验研究［J］.中国实验诊断学，2010，14（6）：808.

［7］Thongkittidilok C，Tharasanit T，Sananmuang T，et al.Insulinlike growth factor－1（IGF－1）enhances developmental competence of cat embryos cultured singly by modulating the expression of its receptor（IGF－1R）and reducing developmental block［J］.Growth Hormone ＆IGF Research，2014，6（5）：720.

［8］王瑛坚，石 磊，潘 颖，等.多囊卵巢综合征患者血清抑制素B、类胰岛素样生长因子－I的测定及临床意义［J］.中国实验诊断学，2010，14（7）：1100.

［9］Kang HJ，Kim JH，Chung SJ.Homogeneous detection of caspase－3using intrinsic fluorescence resonance energy transfer（iFRET）［J］.Biosensors and Bioelectronics，2014，13（2）：1300.

［10］刘 畅，国海东，康湘萍，等.星形胶质细胞产生的趋化因子在阿尔茨海默病发生发展中的作用［J］.生理科学进展，2014，2（5）：125.

Observation of Alzheimer＇s disease model rats of insulin like growth factor－1 and Caspase－3 protein expression

WANG Xuan，WU Cheng－ji，DONG Shu－xin，et al.（First Affiliated Hospital of Jiamusi University Department of Neurology，Jia Mu－si 154000，China）

Objective To observe the change of insulin like growth factor－1and Caspase－3protein expression in Alzheimer＇s disease model rats.Methods 90Wister rats，weight in the range of（240±10g）with normal cognitive function，were randomly divided into three groups，named as the normal group；the control group（normal saline control group（observation group）；Alzheimer＇s disease model rats）.Determination of brain tissues of insulin like growth factor－1with radioimmunoassay（IGF－1），the expression of caspase－3protein by Western blotting.Results the IGF－in the brain tissue of model group rats 1protein expression is lower than the normal group；the observation group in brain tissues of rats with Caspase－3protein expression increased significantly.Comparison between groups with significant difference（P＜0.05）.Conclusion expression of IGF－1protein decreased in the model of brain tissue of Alzheimer＇s disease rats，expression of IGF－1protein was increased.IGF－1protein and IGF－1protein play roles in the development of Alzheimer＇s disease.

Blzheimer＇s disease；Aβ1－40；IGF－1；caspase－3

R749

A

王璇（1973－），副主任医师，硕士。研究方向：脑血管病发病机制及治疗。

2014－08－17）

1007－4287（2015）06－0874－03

黑龙江省青年科学基金项目（QC2011C053）

＊通讯作者