细针穿刺细胞学联合BRAFV600E基因突变检测在甲状腺结节诊断中的价值

张博茗，林元强，隋国庆，王 洋，赵倩倩，王 辉

吉林大学中日联谊医院超声科，吉林 长春 130033

细针穿刺细胞学联合BRAFV600E基因突变检测在甲状腺结节诊断中的价值

张博茗，林元强，隋国庆，王 洋，赵倩倩，王 辉

吉林大学中日联谊医院超声科，吉林 长春 130033

王辉，主任医师，教授，吉林大学博士研究生导师。现任吉林大学中日联谊医院超声科主任，中华医学会超声医学分会委员，中国超声医学工程学会常务理事，吉林省超声医学工程学会会长，吉林省医学会超声医学分会主任委员。主要从事腹部超声、超声造影及介入超声诊断与治疗的临床工作及研究。2012年被中国超声医学工程学会授予优秀超声医学专家奖。担任《中华超声影像学志》、《中国医学影像技术杂志》、《中国临床医学影像杂志》、《中国实验诊断学杂志》、《中国老年医学杂志》和《吉林医学杂志》编委。先后主持省部级科研项目3项，获省教育厅教学成果一等奖1项、三等奖3项，获吉林大学医疗成果二等奖3项、三等奖5项。至今已发表学术论文100余篇，其中SCI收录论文8篇。

目的：研究细针穿刺细胞学(fine-needle aspiration cytology，FNAC)联合BRAFV600E基因突变检测在甲状腺结节诊断中的应用价值。方法：收集2014年6月—2015年6月因甲状腺结节至吉林大学中日联谊医院就诊且经超声检查可疑恶性的患者87例，均行超声引导下FNAC检查和穿刺标本BRAFV600E突变荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测。结果：术后病理诊断为恶性的64例患者中，术前FNAC阳性48例、阴性16例；BRAFV600E突变40例。术后病理诊断为良性的23例患者中，术前FNAC阳性5例、阴性18例；BRAFV600E突变0例。与术后病理结果对照，FNAC对甲状腺癌诊断的灵敏度为75.0%、特异度为78.3%、准确率为75.9%；BRAFV600E突变检测的灵敏度为62.5%、特异度为100%、准确率为72.4%；FNAC联合BRAFV600E突变检测的灵敏度为89.1%、特异度为78.3%、准确率为86.2%。结论：FNAC联合BRAFV600E基因突变检测可提高甲状腺恶性结节诊断的灵敏度。

甲状腺结节；细针穿刺细胞学；BRAF基因突变检测

【Key words】 Thyroid nodule; Fine-needle aspiration cytology; BRAF mutation detection

甲 状 腺 乳 头 状 癌 (papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲状腺癌中最多见的类型，占甲状腺癌的80%～90%[1-2]。目前，甲状腺细针穿刺细胞学检查(fine-needle aspiration cytology，FNAC)以其微创、易行、准确率高的特点，成为临床上诊断甲状腺结节良恶性最常用的方法。但由于细针穿刺所获标本量有限，不能反映病变的全貌，且诊断依赖操作医师及病理医师的经验，文献报道假阴性率在20%左右[3]。因此，寻求一种能提高FNAC对甲状腺恶性结节诊断率的方法势在必行。

BRAF基因位于人染色体7q34，编码丝/苏氨酸蛋白激酶。其突变大多位于第1 799位点腺嘌呤替代了胸腺嘧啶，导致激酶活性片段第600位谷氨酸取代了缬氨酸，从而持续激活BRAF激酶，引起持续的丝裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase kinase，MEK)磷酸化和下游丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路反应，导致肿瘤形成。在多数文献报道中，BRAFV600E突变与肿瘤的发生、分化及侵袭性有关，常见于PTC，且是后者最常见的遗传学事件。但BRAFV600E在甲状腺恶性结节中突变率低，尚不能满足临床诊断需求。如果部分FNAC未能检测出明确诊断的恶性结节中存在BRAFV600E突变，而突变能通过细针穿刺标本检出，那么理论上两者相结合用于诊断甲状腺恶性结节应较单独FNAC更具有临床意义。因此，本研究探讨FNAC联合BRAFV600E突变检测在甲状腺结节定性诊断方面的临床价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料

本研究中87份样本来自2014年6月—2015年6月至吉林大学中日联谊医院就诊的经超声检查认为具有可疑恶性特征的甲状腺结节患者。其中男性28例、女性59例；年龄27～72岁，平均年龄(41.7±9.6)岁。结节大小1.0～2.5 cm。超声表现为实性低回声的结节87个，形态不规则的结节51个，纵横比＞1的结节33个，内可见微钙化或砂砾样钙化的结节37个，血流丰富的结节15个，伴颈部淋巴结形态异常的结节19个。

1.2 穿刺方法

患者排除FNAC禁忌证，术前签署知情同意书。取仰卧位，肩部垫高15°～30°，保持头颈部过伸位。超声下定位穿刺点，皮肤消毒，铺无菌洞巾，2%利多卡因局部麻醉，使用TSK一次性负压吸引穿刺针(21G)，超声引导下沿预定针道进入结节中心，负压状态下多点抽吸≥5次，标本涂片3～4张，95%乙醇固定(图1)。

图1 超声引导下FNAC

1.3 细胞学诊断方法

按照甲状腺细胞病理学Bethesda分类标准：① 标本不满意或不能诊断；② 良性；③ 不能明确意义的不典型病变或滤泡性病变；④ 滤泡性新生物；⑤ 可疑恶性；⑥ 恶性。本研究将⑤、⑥ 统一归类为细胞学阳性，将①～④归类为细胞学阴性(图2)。

图2 甲状腺乳头状癌FNAC涂片

1.4 BRAF基因突变检测

根据组织/细胞基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明书提取DNA。用BRAFV600E突变检测试剂盒(武汉友芝友医疗科技有限公司)将DNA样本与聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)缓冲液、引物探针等制成反应液，利用荧光定量PCR仪对荧光信号强度进行检测，计算ΔCt值(ΔCt值=突变检测Ct值-质控检测Ct值)，结果定性分析(图3)。

图3 BRAFV600E突变样本检测图

1.5 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件进行分析，率的比较采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 手术病理结果

87例甲状腺结节患者全部经手术切除。术后病理为：恶性64例中，乳头状癌63例、滤泡状癌1例；良性23例全部为结节性甲状腺肿，其中5例伴局部滤泡上皮异型增生。

2.2 FNAC与术后病理对照

与术后病理对照，术前FNAC诊断甲状腺癌的灵敏度为75.0%(48/64)，特异度为78.3% (18/23)，准确率为75.9%(66/87)。详见表1。

2.3 BRAFV600E突变检测与术后病理对照

术后病理诊断为恶性的64例患者中，术前检测到BRAFV600E突变40例；术后病理诊断为良性的23例患者中，术前未检测到BRAFV600E突变。且术前检测出BRAFV600E突变的40例患者术后病理均证实为乳头状癌。

与术后病理对照，BRAFV600E突变检测诊断甲状腺癌的灵敏度为62.5%(40/64)，特异度为100%(23/23)，准确率为72.4%(63/87)。详见表2。

表1 术前FNAC与术后病理结果对照

表2 术前BRAFV600E检测与术后病理结果对照

2.4 FNAC联合BRAFV600E突变检测与术后病理对照

FNAC联合BRAFV600E突变检测诊断甲状腺癌的灵敏度为89.1%(57/64)，特异度为78.3% (18/23)，准确率为86.2%(75/87)。均高于单独BRAFV600E突变检测，差异有统计学意义(P＜0.05)。详见表3。FNAC联合BRAFV600E突变检测的灵敏度高于单独FNAC，差异有统计学意义(P＜0.05)，两者特异度比较差异无统计学意义(P＞0.05)，准确率比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见表4。而FNAC与BRAFV600E突变均为阳性的31例患者术后病理全部为恶性。

表3 术前FNAC联合BRAFV600E突变检测与术后病理结果对照

表4 术前FNAC、BRAFV600E突变检测与两者联合的诊断率比较

3 讨 论

超声引导下甲状腺结节FNAC检查作为临床最常用的甲状腺结节良恶性鉴别方法，具有快捷、准确率高的优势。对于有经验的医师，FNAC的灵敏度波动于65%～98%，平均值约为83%，特异度波动于72%～100%[4]。但其仍有一定局限性：如病理呈不典型表现，无乳头状结构或细胞核仅轻微改变，造成乳头状癌的假阴性；由于细针穿刺所获标本量有限，且标本中的组织形态和细胞间质结构大部分或完全破坏，不能反映肿瘤外血管或包膜的侵犯程度，无法鉴别滤泡状腺瘤与滤泡状癌；或者结节内部血流丰富，过多红细胞污染涂片；另外，操作医师及病理医师的经验也对FNAC结果有较大影响。本研究显示，单独FNAC的灵敏度为75.0%，16例乳头状癌患者被诊断为良性，因穿刺过程中未取得结节中恶性病变部位所致；FNAC的特异度为78.3%，5例假阳性患者细胞病理发现异型性或乳头状增生，诊断为乳头状癌或倾向于乳头状癌，但术后病理未达到诊断标准。因此，FNAC诊断甲状腺结节的正确率尚不能完全满意。

BRAFV600E突变与乳头状癌的发生有着密切关系，文献报道29%～83%的乳头状癌可检测出BRAFV600E突变[5-7]，而良性病变则不表达。本研究术前发现BRAFV600E突变的40例患者经术后病理证实均为乳头状癌，且良性病变23例均未发现BRAFV600E突变，表明BRAFV600E突变是与良性病变无关的遗传学事件。尽管BRAFV600E突变诊断乳头状癌的特异度为100%，但其突变率低导致灵敏度及准确率均低于FNA，因此也不能满足临床诊断甲状腺结节的需求。

由于检测到BRAFV600E突变即可诊断为乳头状癌，在FNAC基础上联合BRAFV600E突变检测，不会增加假阳性率，两者特异度无差别。乳头状癌在临床发现的甲状腺癌中占绝大多数(80%～90%)，提高乳头状癌检出率能间接提高甲状腺癌的术前检出率。对于部分病理呈不典型改变、FNAC未作出恶性诊断的结节，可检测到BRAFV600E突变，那么FNAC联合BRAFV600E突变检测与单独FNAC比较，能提高甲状腺癌的检出率(灵敏度)，本研究的灵敏度由75.0%提升至89.1%。且FNAC与BRAFV600E突变检测均为阳性的患者，术后病理证实准确率为100%。BRAFV600E突变检测虽然对良性结节诊断无意义，但理论上可通过提高恶性结节的检出率提升诊断的总体符合率。本研究中准确率比较差异无统计学意义的原因可能与样本量有限有关，有待进一步探讨。

此外，BRAFV600E突变与乳头状癌对周围组织的高侵袭性相关，是中央组淋巴结转移率的预测因子，还可引起肿瘤细胞对放射性碘的摄取力降低，导致放射性碘治疗失败，是判断预后的影响因子[8-9]。因此，术前FNAC检查不但能提高甲状腺癌的检出率，还能提示病变的恶性程度，并为预后评估提供依据。

4 结 语

综上所述，甲状腺结节细针穿刺检测BRAFV600E突变方法可靠，与FNAC联合能提高甲状腺恶性结节诊断的灵敏度，同时可能有助于筛选出高危甲状腺癌病例，指导手术方式及术后选择后续治疗方案。

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ZHANG Boming, LIN Yuanqiang, SUI Guoqing, WANG Yang, ZHAO Qianqian, WANG Hui (Department of Ultrasound, China-Japan Union Hospital of Jilin University, Changchun 130033, Jilin Province, China)

WANG Hui E-mail: wanghui19620708@aliyun.com

Objective:To investigate the application value of fine-needle aspiration cytology (FNAC) combined with BRAF mutation detection in the diagnosis of thyroid nodules.Methods:A total of 87 patients who were diagnosed as suspicious malignant thyroid nodules by ultrasonic examination from June 2014 to June 2015 were selected. All the patients underwent FNAC and BRAF mutation detection by fluorescence polymerase chain reaction (PCR).Results:Among 64 malignant cases, 48 cases were positive and 16 cases were negative for FNAC, and 40 cases had BRAFV600Emutation. Among 23 benign cases, 5 cases were positive and 18 cases were negative for FNAC, and no case had BRAFV600Emutation. Compared with the postoperative pathological results, the sensitivity was 75.0%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 75.9% for FNAC. The sensitivity of BRAF mutation detection was 62.5%, the specificity was 100.0%, and the accuracy was 72.4%. The sensitivity was 89.1%, the specificity was 78.3%, and the accuracy was 86.2% for FNAC combined with BRAFV600Emutation detection.Conclusion:FNAC combined with BRAFV600Emutation detection can improve the sensitivity of diagnosis of malignant thyroid nodules.

R445.1

A

1008-617X(2015)04-0259-05

2015-11-30）

吉林省科技发展计划项目(No：20130206020SF)

王辉 E-mail：wanghui19620708@aliyun.com

The value of fine-needle aspiration cytology combined with BRAFV600E mutation detection in diagnosis of thyroid nodules