半滑舌鳎体表溃疡病病原的分离鉴定❋

徐晓丽, 邵 蓬， 李贺密， 姚学良， 郑艳坤， 包海岩

(天津市水产技术推广站，天津 300221)



研究简报

半滑舌鳎体表溃疡病病原的分离鉴定❋

徐晓丽, 邵 蓬， 李贺密， 姚学良， 郑艳坤， 包海岩❋❋

(天津市水产技术推广站，天津 300221)

为研究引起半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)体表溃疡病的病原，从发生体表溃疡的半滑舌鳎体表病灶、肝脏和肾脏上进行细菌分离，得到2株优势菌株051001和051002，采用腹腔注射进行回感实验，证实菌株051001和051002能够引起养殖半滑舌鳎发病死亡，该菌株为本次半滑舌鳎体表溃疡病的致病菌。经形态学观察和生理生化特性分析，初步判定菌株051001为鱼肠道弧菌(Vibrioichthyoenteri)、菌株051002为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)；基于16S rRNA基因构建的系统发育树显示，菌株051002与哈维氏弧菌聚为一支，菌株051001与鱼肠道弧菌聚为一个分支；基于hsp60的基因序列分析表明051002与哈维氏弧菌(AY332570、AF230931)聚为一个分支，置信度为92%。对16种药物的敏感实验证实，菌株051001对利福平、庆大霉素、氟苯尼考等敏感，菌株051002对诺氟沙星、头孢曲松钠、庆大霉素敏感。

半滑舌鳎;体表溃疡病；弧菌;病原鉴定;药敏实验

半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)俗称鳎目、鳎米，隶属于鲽形目(Pleuronectiformes)舌鳎科(Cnoglossidae)舌鳎属(Cynoglossus)，主要分布于中国黄渤海海域，东海、南海、朝鲜半岛及日本海域也有分布。半滑舌鳎是鲆鲽类养殖中的珍贵品种，因味道鲜美、营养丰富，深受广大消费者青睐，市场价格居高不下。因苗种规模化人工繁育技术的突破，半滑舌鳎工厂化养殖在中国沿海地区迅速兴起并形成产业，已成为河北、天津沿海海水养殖鱼类的主导鱼种。随着养殖规模不断扩大，各种疾病也随之发生，其中体表皮肤溃疡病是近年来严重危害天津地区半滑舌鳎养殖产业发展的一种疾病。该病全年均有发生，各龄鱼均可发病，病程缓慢，全市各半滑舌鳎养殖场、养殖池均有不同程度的发病病鱼。病鱼的症状主要表现为鳍基部出血、溃烂，体表溃疡，溃疡处不断扩大形成溃烂，病鱼不食，最终死亡；部分症状较轻的病鱼，会有自愈现象，但在溃烂处会留下明显的疤痕，影响其商品价值。因体表皮肤溃疡病的导致半滑舌鳎的产量急剧下降，经济损失巨大，这已影响到半滑舌鳎产业在天津地区的存亡和发展。

对于半滑舌鳎的体表溃疡症，国内已有学者对其进行了研究：陈政强等[1-2]从患病半滑舌鳎体内分离到2株弧菌鉴定为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)和轮虫弧菌(V.rotiferianus)，人工感染实验证实2株菌均可独立引起半滑舌鳎发病死亡，且具有较强毒性；张晓君等[3]从鳃盖及鳍基出血、尾鳍腐烂的半滑舌鳎病鱼肝脏、腹水中分离到大量优势生长的鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)；王燕[4]等认为该病的病原为美人鱼发光杆菌杀鱼亚种(Photobacteriumdamselaesubsp.Piscicida)；但也有学者从溃烂的体表部位分离到了假单胞菌属细菌。本研究取患病半滑舌鳎进行病原分离，得到2株优势菌株，采用形态学、生化特性分析结合16S rRNA及hsp60基因对所分离的菌株进行鉴定，并对其致病性及药物敏感性进行分析，旨在探究天津地区半滑舌鳎溃疡病的发病病原及其特性，为该病的诊断与防治提供科学参考和依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

患病半滑舌鳎取自天津市海发珍品实业发展有限公司，发病鱼体长15～25cm，体表及鳍已形成明显溃烂。健康半滑舌鳎30尾取自天津兴盛海淡水养殖公司，体长(15±2) cm，体质量(35±3) g，暂养于75L水族箱，采用充气泵增氧，每天投饵2次，吸污1次，实验期间保持养殖水温25℃，盐度2。2216E、TSB、TCBS培养基、弧菌科细菌生化鉴定管、药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2 病原菌分离

取体表溃烂症状典型的半滑舌鳎，刮取体表黏液、鳃及溃烂处组织等在显微镜下检查是否有寄生虫和真菌。用酒精棉球擦拭病鱼尾部，用2.5mL无菌注射器从病鱼尾静脉取血0.5mL，并迅速将所取的血液涂布于2216E平板；取接种环从体表溃烂处深处接种细菌，划线接种于2216E平板；无菌操作取病鱼的肝、脾、肾等部位，加入灭菌的磷酸盐缓冲液(PBS)研磨，取研磨液划线接种于2216E平板，25℃培养24h，挑取形态一致的优势菌落进行纯化培养，直至获得纯培养菌株，以TSB冻存液(含15%甘油的TSB培养基)保存于-80℃备用。

1.3 人工感染实验

感染实验用半滑舌鳎饲养于45L玻璃缸中，分3组，每组10尾，其中2组为实验组，注射不同菌株，1组为对照组。

感染实验用菌株于TSB培养基中培养24h后，用无菌PBS洗涤3次，以含0.85% NaCl的生理盐水，将用于感染实验的2株菌悬液的密度调整为3×107cfu/mL。感染实验采用腹腔注射方式进行，实验组每尾舌鳎注射0.1mL菌液，对照组注射等量无菌PBS。注射后连续观察实验鱼，每天正常饲养并换水吸污，记录半滑舌鳎的发病和死亡情况，并从人工感染发病的濒死鱼中，取患病症状与自然患病鱼相似的再次分离、纯化细菌。

1.4 病原分离与生理生化鉴定结果

将纯化的细菌划线接种于2216E和TCBS平板，28℃培养24h后，观察菌落特征，并进行革兰氏染色观察细菌形态。挑取单菌落接种于生化鉴定管中，参照《常见细菌系统鉴定手册》[5]和《伯杰氏细菌学鉴定手册》[6]进行细菌理化特性鉴定。

1.5 分子生物学鉴定

模板DNA的制备 挑取纯培养的待测细菌单菌落，悬浮于50μL无菌去离子水中，沸水煮5min，冰上冷却后瞬时离心，取上清液作为PCR反应的模板。

基因序列的PCR扩增与测序 16S rRNA基因序列的扩增参照文献[7]中的方法进行。hsp60基因序列的扩增参照李宁求等[8]的方法进行，PCR产物回收后直接送至天津华大基因科技有限公司进行测序。

16S rRNA 和hsp60基因序列分析与系统发育树的构建 将测序所得分离菌的16S rRNA和hsp60基因序列提交至Gene Bank数据库中，通过NCBI的Blast检索系统进行同源性分析。选取与所得菌株同源性较高的菌株的基因序列，采用Clustal x 1.81软件比对后，分别以16S rRNA和hsp60为分子标记，用系统发育分析软件Mega 5.2基于邻接法(Neighbor-joining，NJ法)构建系统发育树，通过Bootstraps进行置信度检测，自举数集1000次。

1.6 药物敏感实验

采用药敏纸片法分析所分离菌株的药物敏感性，以无菌棉签分别蘸取密度为1.5×108cfu/mL菌液均匀涂布于平板，用无菌镊子将药敏纸片均匀贴在平板培养基表面，28℃培养箱中培养24h，记录各药敏纸片的抑菌圈直径(mm)，并按照药敏纸片抑菌范围解释标准判断实验结果。

2 结果

2.1 病鱼检查结果

患病的半滑舌鳎不食，反应迟钝，游泳无力，体表皮肤背负面有不同大小的溃疡、溃烂面，鳍基部出血、溃烂，有的病鱼腹部膨大内有腹水，肠道鼓出几乎脱出肛外，肠壁薄内充液体，解剖发现病鱼肝脏发白或充血发红，肠道无食，胆囊肿大。取鳃、体表黏液及病变组织制作水浸片显微镜下观察，未发现真菌及寄生虫。

图1 患病的半滑舌鳎症状

2.2 病原分离及常规鉴定结果

从病鱼血液、内脏研磨液、体表溃烂深处分离到2株优势菌株，编码051001、051002。菌株051001在TCBS培养基上形成圆形光滑、边缘整齐的黄色菌落，菌落直径约为1mm，呈革兰氏阴性短杆状，菌体长1～3μm，无荚膜(见图2a)，具运动性，发酵型代谢，V-P反应阴性，还原硝酸盐，不产生吲哚，β-半乳糖苷酶、淀粉酶、明胶酶、尿酶均为阴性，对O/129(150μg)敏感，能够利用蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖等，不能利用柠檬酸盐、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、水杨苷、纤维二糖等(见表1)。菌株051001的生化特性与鱼肠道弧菌(V.ichthyoenteri)较为一致，初步判定菌株051001为鱼肠道弧菌。菌株051002在TCBS培养基上形成圆形、光滑湿润、中心略隆起的深黄色菌落，直径约1.5mm，呈革兰氏阴性短杆状，菌体长2～4μm，无荚膜(见图2b)，具运动性，发酵型代谢，V-P反应阴性，还原硝酸盐，产生吲哚，β-半乳糖苷酶阴性，淀粉酶、明胶酶、尿酶均为阳性，对O/129(150μg)敏感，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶均为阳性，能够利用甘露醇、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、糊精、纤维二糖等，不能利用蔗糖、山梨醇、肌醇、阿拉伯糖、蜜二糖等(见表1)。菌株051002的生化特性与哈维氏弧菌(V.harveyi)较为一致，初步判定菌株051002为哈维氏弧菌。

图2 菌株051001和051002的菌体形态Fig.2 The morphous of 051001 and 051002 strains

表1 菌株051001、051002的生理生化特性鉴定结果

注：+： 阳性； -： 阴性；S： 敏感；F： 发酵型；d： 菌株间不稳定反应。

Note: +： Positive; -： Negative; S： Sensitive; F： Fermentation; d： Sometimes negative, sometimes positive.

2.3人工感染实验

以纯培养的菌株051002菌液感染健康的半滑舌鳎，感染结果如下：在感染3d后注射部位开始掉鳞，出现小白点；6d后形成小的溃疡，被感染鱼游动缓慢，很少吃食；11d后部分鱼腹部出现隆起，溃疡处有红色出血点；19d后被感染鱼开始出现死亡，溃疡面扩大；33d后被感染鱼全部死亡，感染死亡的病鱼，体表皮肤有明显溃疡，有的有腹水，肠道无食，与自然感染症状相似。以纯培养的菌株051001菌液感染健康的半滑舌鳎，初期在注射部位有轻微掉鳞，继而鳍周边出现出血溃烂点，鱼不食，第26天开始出现死亡，至第35天感染实验结束，死亡6尾鱼，整个感染实验病情发展相对缓慢，烂鳍程度与自然发病鱼相比较轻。而对照组无一死亡，未表现出明显异常(见表2)。从人工感染后发病的濒死鱼内脏及腹水接菌划线于TCBS平板，得到与感染用菌株形态一致的黄色菌落，新分离株的理化特性与原感染菌一致。

表2 菌株051001、051002的人工感染实验结果

Note： ①Bacterial concentration；②Dose；③Total No；④Death No；⑤Mortality；⑥Control

2.4 16S rRNA 和hsp60基因序列分析及系统发育树构建

对所分离菌株051001、051002进行了16S rRNA基因序列扩增，得到1500bp的核酸片段。将测序所得序列提交至NCBI进行BLAST分析，结果显示：菌株051001与鱼肠道弧菌(DQ003270)的16S rRNA基因序列高度一致，相似度为98.03%；菌株051002与哈维氏弧菌、轮虫弧菌(V.rotiferianus)、鲨鱼弧菌(V.carchariae)等的16S rRNA基因序列相似度均在99%以上。以16S rRNA基因为遗传标记构建的系统发育树显示：菌株051001与鱼肠道弧菌聚为一支，置信度为99%；菌株051002与哈维氏弧菌聚为一支，但置信度不高(见图3)。以hsp60基因序列为遗传标记构建的系统发育树结果显示，菌株051002与哈维氏弧菌(DQ279071)聚为一个分支，置信度为92%(见图4)。结合菌株生理生化特性与16S rRNA及hsp60基因序列的分析结果，判定菌株051001为鱼肠道弧菌，菌株051002为哈维氏弧菌。

图3 以16S rRNA基因构建的弧菌属细菌系统发育树

图4 以hsp60基因构建的V. harveyi系统发育树

2.5 药敏试验结果

使用16种抗生素对菌株051001、051002进行药敏试验。菌株051001对利福平、氟苯尼考、庆大霉素等敏感，对诺氟沙星、恩诺沙星中毒敏感，对磺胺异恶唑、呋喃唑酮青霉素等具有抗性；菌株051002对诺氟沙星、头孢曲松钠、庆大霉素敏感，对阿奇霉素中度敏感，对氟苯尼考、恩诺沙星等具有抗性，2株菌株均对庆大霉素敏感。

表3 菌株051001、051002的药敏实验结果

注：S表示敏感 Sensitive；R表示抗性Resistant；I表示中度敏感 Intermediate。

①Roxithromycin；②Doxycycline；③Enrofloxacin；④Sulfafurazole；⑤Rifampicine；⑥Furazolidone；⑦Florfenicol；⑧Novobiocin；⑨Streptomycin；⑩G Penicillin；Azithromycin；Norfloxacin；Rocephin；Gentamicinum；Furazolidone；Amikacin

3 讨论

鱼类体表溃疡病是养殖鱼类的多发疾病，牙鲆(Paralichthysolivaceus)、香鱼(Plecoglossusaltivelis)、许氏平鲉(sebastesschlege/i)、石斑鱼、红鳍东方鲀(Fugurubripes)、花鲈(Lateolabraxjaponicus)、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)、鮸鱼(Miichthysmiiuy)等都有过报道。目前，从发生体表溃疡病的病鱼体内先后分离到鳗利斯顿氏菌(Listonellaanguillarum)、哈维氏弧菌、鱼肠道弧菌、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、鰤鱼诺卡氏菌(Nocardiaseriolea)、海洋屈挠杆菌(Tenacibaculummaritimum)、杀鲑气单胞菌(Aeromonassalmonicida)等[1-4,7-8,16-20]。本研究从患体表溃疡病的半滑舌鳎体表和体内同时分离到哈维氏弧菌和鱼肠道弧菌，人工感染实验证实该2株菌可引起半滑舌鳎发生体表溃痒、烂鳍等症状，进一步证实该病可能是由多种病原感染引起[21]。本次人工感染实验的病鱼病情发展缓慢，致死性不强，与自然状态下半滑舌鳎体表溃疡病病程长、死亡率不高相一致。张正[22]通过对感染皮肤溃疡病的半滑舌鳎的组织病理学研究，认为导致病鱼死亡的最终原因是在体表显著的病变特征出现之前，病鱼的多个组织器官可能已经被病原感染，而病变使器官的功能衰竭以及全身的血液循环障碍，并逐渐丧失正常的生理代谢。这解释了自然或人工感染状态下，半滑舌鳎体表溃疡病发病周期长，并未出现大规模急性死亡的原因。

在对本研究所分离出的菌株进行鉴定过程中，采用了最常用的16S rRNA基因序列分析，一般认为16S rRNA基因同源性大于97.5%的细菌菌株可视为同种[23]。本研究中，菌株051002与哈维氏弧菌、轮虫弧菌、鲨鱼弧菌等的16S rRNA基因序列相似度均在99%以上，不能确定该菌种的分类地位。热激蛋白hsp基因是另一种常用于生物进化及分类的大分子物质，进化速度比16S rRNA快，在系统进化中相对保守且在不同种间具有足够的多态性，广泛应用于亲缘关系较近的细菌的分类鉴定，Kwok等的研究表明hsp60基因适合用于研究海洋弧菌系统分类[24]。本研究扩增了菌株051002的hsp60基因并构建了以hsp60为遗传标记的系统发育树，结果显示051002与哈维氏弧菌聚为一支，具有较高的置信度。由此结合细菌的形态学、生化特性及分子生物学鉴定结果，判定菌株051001为鱼肠道弧菌，菌株051002为哈维氏弧菌。

对于半滑舌鳎体表溃疡症状的治疗，最常用的措施还是施用抗生素。本研究采用药敏纸片法分析了所分离菌株对16种抗生素的敏感性，结果显示2株菌株同时敏感的药物仅有庆大霉素，而在国标渔药中仅有注射用复方硫酸庆大霉素可用于亲鱼产后康复或河蚌育珠，并无庆大霉素直接用于食用鱼类的许可。2株菌对水产常用甚至不用的抗生素具有不同程度的抗性，也提示了大量使用抗生素所造成的细菌耐药性产生及环境中抗生素的污染。鉴于半滑舌鳎体表溃疡病发病周期长，因此在生产上对于这种疾病还是应以预防为主，日常管理中经常观察池中鱼的生理状态变化，及时捡出活力弱或摄食不佳的鱼隔离饲养，采取有效的消毒措施，降低养殖密度，使用免疫增强剂增强鱼的体质，减少鱼体应激，倒池时小心操作尽量避免鱼体受伤，这些措施均能够降低该病的暴发机率。

[1] 陈政强, 姚志贤, 林茂, 等. 半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究 [J]. 水产学报, 2012, 36(5): 764-771.

[2] 陈政强, 姚志贤, 林茂, 等. 半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌(Vibriorotiferianus)的分离与鉴定 [J]. 生物技术通报, 2012, 6: 147-153.

[3] 张晓君, 阎斌伦, 梁利国, 等. 半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌双重PCR检测方法的研究 [J]. 海洋通报, 2011, 30(4): 430-434.

[4] Wang Y, Han Y, Li Y, et al．Isolation ofPhotobacteriumdamselaesubsp．piscicida from diseased tongue sole (CynoglossussemilaevisGünther) in China [J]．Acta Microbiologica Sinica， 2007, 47 (5): 763-768．

[5] 东秀珠, 蔡妙英. 常见细菌系统鉴定手册[M]. 北京:科学出版社, 2001.

[6] Brenner D J, Krieg N R, Staley J T. Bergey′s manual of systematic bacteriology [M]. 10th Edn. New York: Springer-Verlog, 2004.

[7] 徐晓丽, 邵蓬, 崔宽宽, 等. 剑尾鱼烂鳃、烂尾病病菌的分离鉴定 [J]. 淡水渔业, 2014, 44(1): 66-72.

[8] 徐晓丽, 邵蓬, 李灏, 等. 豹纹鳃棘鲈致病性哈维氏弧菌的分离鉴定与系统发育分析 [J]. 华中农业大学学报, 2014, 33(4): 112-118.

[9] 王庚申. 养殖许氏平鲉两种细菌性病原的分离、鉴定及组织病理学研究 [D]. 上海： 上海海洋大学, 2012.

[10] 张晓君, 陈翠珍, 阎斌伦， 等. 红鳍东方鲀病原鱼肠道弧菌的生物学特性研究 [J]. 水生生物学报, 2009, 33(6): 1118-1125.

[11] 陈翠珍, 房海, 张晓君, 等. 牙鲆鱼肠道弧菌感染症及病原特性研究 [J]. 热带海洋学报, 2006, 25(5): 80-86.

[12] 江小斌. 斜带髭鲷感染鱼肠道弧菌的分离及分析 [J]. 安徽农业科学, 2013, 41(13): 5747-5749.

[13] 张晓华, 钟英斌, 陈吉祥. 哈维氏弧菌的生物学特性、流行病学及检测技术 [J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2007, 37(5): 740-748.

[14] 周永强, 李登峰, 彭姣, 等. 养殖三疣梭子蟹体内哈维氏弧菌的分离与致病性鉴定 [J]. 应用海洋学学报, 2013, 32(2): 215-221.

[15] 张凤萍, 彭志兰, 张健, 等. 鮸鱼弧菌病病原菌(哈维氏弧菌)的分离与鉴定 [J]. 微生物学报, 2010, 50(3): 304-309.

[16] 吕俊超, 张晓华, 王燕, 等. 养殖大菱鲆病原菌—杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和组织病理学研究 [J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2009, 39(1): 91-95.

[17] 徐晓丽, 李贺密, 邵蓬, 等. 丝足鲈致病性诺卡氏菌的鉴定及系统发育分析 [J]. 水产科学, 2013, 32(11): 657-661.

[18] 李长红, 陈炯, 史雨红, 等. 宁海地区香鱼弧菌病病原菌鉴定 [J]. 微生物学报, 2009, 49(7): 931-937.

[19] 林星. 花鲈皮肤溃疡病病原菌的分离与鉴定 [J]. 中国农学通报, 2013, 29(32):100-104.

[20] 梁利国, 谢骏. 青鱼病原嗜水气单胞菌分离鉴定、毒力因子检测及药敏试验 [J]. 生态学杂志, 2013, 32(12): 3236-3242.

[21] 张正, 王印庚, 王岚, 等. 养殖半滑舌鳎主要疾病及流行特征的初步调查 [J]. 水产科技情报, 2012， 39(2): 65-69.

[22] 张正. 养殖半滑舌鳎常见疾病的病理学观察与感染微生态分析 [D]. 青岛： 中国海洋大学, 2012.

[23] 塞文婴, 东秀珠. 定向进化同源基因在细菌系统进化研究中的应用 [J]. 微生物学通报, 2000, 27(5): 377-381.

[24] Kwok A Y, Chow A W. Phylogenetic study of Staphylococcus and Macrococcus species based on partial Hsp60 gene sequences [J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53(1): 87-92.

责任编辑 朱宝象

Isolation and Identification of the Pathogens of the Skin Ulceration Disease ofCynoglossussemilaevis

XU Xiao-Li, SHAO Peng, LI He-Mi, YAO Xue-Liang, ZHENG Yan-Kun, BAO Hai-Yan

(Tianjin Fishery Technical Extension Department, Tianjin 300221, China)

The aims of this research were to isolate the pathogens of the skin ulceration disease ofCynoglossussemilaevisand to identify the sensitivity to antibiotics. Two dominant bacterial strains documented as 051001 and 051002 were isolated from the skin, liver and kidney of dyingC.semilaevis. Both strains could cause the mortality of healthyC.semilaevisindependently in artificially challenge and were proved to be pathogens ofC.semilaevis. Based on the results of morphological observation, physio-logical and biochemical characterization and 16S rRNA gene sequence, strain 051001 was identified asVibrioichthyoenteriand strain 051002 wasV.harveyi. Phylogenetic tree ofVibriobased onhsp60 gene indicated that strain 051002 showed the highest level of similarity toV.harveyi, and the bootstrap was 92%. Antibiotic sensitivity analysis showed that strain 051001 was susceptible to rifampicine, florfenicol, furazolidone, gentamicinum and streptomycin; while strain 051002 was susceptible to norfloxacin, rocephin and gentamicinum.

Cynoglossussemilaevis; skin ulceration disease;Vibrio; pathogen identification; antibiotic sensitivity analysis

天津市科技支撑计划项目(12ZCZDNC00900)；天津市农业科技成果转化项目(13ZXNZNC07700)资助

2014-07-03；

2014-09-11

徐晓丽(1983-)，女，工程师，研究方向：水产动物病害学。E-mail: xiaolixu1983@gmail.com

❋❋通讯作者： E-mail: scjstgz688@163.com

S 941.41+7

A

1672-5174(2015)11-029-07

10.16441/j.cnki.hdxb.20140217