三株BHK－21悬浮细胞培养特性比较

武发菊，尚勇良，孙玉霞，董文教，安芳兰，万玉林，刘学荣，杨进才

（中农威特生物科技股份有限公司，甘肃兰州 730046）

叙利亚仓鼠肾细胞或称金黄色仓鼠肾细胞（BHK－21）来源方便，繁殖速度快，质量和外源因子易控制，是经世界卫生组织（World Health Organization，WHO）推荐作为生产兽用疫苗的细胞，适合于多种疫苗的大规模工业化生产［1－3］。而细胞培养的研究则是优化培养工艺、提高疫苗产品质量的核心部分［4］。目前，用于BHK－21细胞培养商品化的培养基主要有MEM、DMEM、GMEM、SLM和无血清培养基等。本试验采用自制的GMEM细胞培养基进行试验，该培养基是在基础培养基MEM的基础上，根据本室保存的BHK－21悬浮细胞的生长特性，研发的个性化专用培养基，使用时添加30mL／L的血清。应用此培养基通过批式培养本室保存的3株BHK－21细胞，比较了细胞培养过程中细胞的浓度、细胞活性、比生长速率和细胞周期分布变化等培养特性，以进一步认识BHK－21细胞的培养特性，为大规模工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 本实验室保存的悬浮培养细胞种子共有3个，分别是ECACC引进的悬浮培养BHK－21C13－2P株、ATCC引进的 BHK－21－L株和中国兽医药品监察所引进的BHK－21－B株，经本实验室驯化适应悬浮培养。

1.1.2 试剂 GMEM培养基（即MEM培养基，含高糖）、胰酶为Hyclone公司产品，使用前按照产品说明书配制；新生牛血清为国产产品，本试验使用的培养基为GMEM添加30mL／L小牛血清；细胞周期和细胞凋亡率测定试剂盒为碧云天生物技术公司产品；碳酸氢钠、氢氧化钠、盐酸等常用试剂为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器 细胞计数仪为德国INNOVATIS公司产品；FACS2Calibur型流式细胞仪为美国BD公司产品；5L生物反应器为美国NBS公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 从细胞库中取出 BHK－21C13－2P株、BHK－21－L株和BHK－21－B株3个细胞种子，分别在100mL小方瓶中加入12mL培养基进行复苏培养，按1∶3～1∶5的接种比例传代培养。选择生长良好的贴壁细胞消化后，以细胞密度为0.75×106个／mL转入摇瓶进行扩大培养。待细胞形态良好，逐级放大至5L生物反应器进行批式培养试验（接种密度为0.3×106个／mL）。每隔24h取样观察细胞形态，分析细胞。

1.2.2 细胞计数与分析

1.2.2.1 细胞形态的观察及数目和活力的测定将取出的细胞悬浮液直接滴在载玻片上显微镜下观察；利用细胞分析仪计数细胞，分析细胞活力。

1.2.2.2 细胞比生长速率（μ）的计算μ＝lnX2－lnX1／t2－t1

式中X为细胞密度；t为培养时间。

1.2.2.3 细胞周期和细胞凋亡率的测定 采用PI染色法，在流式细胞仪进行细胞周期和细胞凋亡的测定。

2 结果

2.1 3个细胞株培养形态的比较

从形态图1可见，当3株细胞处于最佳状态时，在普通显微镜下观察对比，细胞都呈圆球形，边缘光滑，胞质透光性好，细胞直径在10μm～15μm之间。不同的是BHK－21C13－2P细胞形态较大一点，在培养液中单个存在，细胞分散均匀，几乎不接团；BHK－21－B株在镜下细胞透亮似水珠，易结团；BHK－21－L株细胞则很少结团。因此，这3种细胞在形态上无明显的差异，在显微镜下区别不明显。

图1 三种细胞株培养形态的比较Fig.1 The comparison of culture morphology of three cell lines

2.2 批式培养过程中细胞生长曲线比较

以同一接种密度进行细胞培养，细胞生长曲线（图2）。3种细胞的生长趋势基本相同。在0h～24h，细胞处于潜伏期，细胞数目稍有增加；在培养至24h～48h为指数生长期，细胞生长代谢旺盛，细胞数目剧增，为初始浓度的6倍～10倍；在培养至48h～72h，由于营养物质的耗竭、代谢副产物的积累、细胞接触抑制现象的出现，细胞缓慢生长，使得细胞数目增加缓慢或未增加，此期为细胞的平稳生长期；继续培养，细胞数目骤减，细胞迅速衰亡。另外，比较发现，ATCC的BHK－21－L细胞株较其他2种细胞提前进入了细胞衰亡期，这可能是由于细胞生长能力强，使营养物质缺乏引起的。

另外，在细胞计数仪测定细胞密度时，也反映了批式培养生长过程中细胞的平均粒径大小、结团情况等培养特性（图3）。在同一初始接种密度（0.3×106个／mL）下，BHK－21－L细胞不仅达到了最大培养密度，即4.3×106个／mL，且结团很少；其次为BHK－21－B细胞，最大培养密度为3.2×106个／mL，细胞易结团；BHK－21C13－2P细胞株在整个培养过程中几乎不结团，但其最大培养密度只有2.4×106个／mL，我们在长期的培养中发现，该细胞在提高初始接种密度后，最高细胞密度可达5×106个／mL～6×106个／mL。

可见，ATCC的BHK－21－L细胞株在较低的初始接种密度下生长，在前期培养中不仅细胞形态较好，且细胞数能增长10倍～15倍，易于放大培养，更适合于细胞规模化生产。

图2 细胞数量随培养时间变化的比较Fig.2 The comparison of cell counts with culture time

图3 3种细胞株细胞特性的比较Fig.3 The comparison of cell characteristics of three cell lines

2.3 批式培养过程中细胞活性的比较

3种细胞的活力随培养时间的延长，在48h后逐渐下降。原因可能是在细胞培养的初期，由于营养物质、生存空间等比较充足，溶氧度、pH环境等比较适合细胞生长，细胞活力比较高。但培养48h后，细胞之间为了争夺有限的营养物质、生存空间等，必然导致一部分细胞死亡，细胞活力下降。另外，在细胞生长良好时，BHK－21－L细胞株长活性在96%左右，较其他两株的细胞活性高（图4）。

图4 细胞活性随培养时间变化的比较Fig.4 The comparison of cell activities with culture time

2.4 批式培养过程中比生长速率的比较

从表1可见，BHK－21－L细胞在24h～48h，比生长速率最高；但整体趋势都是随着细胞的生长，不同时间的平均比生长速率不同，有一个先升后将的过程。比生长速率的变化与前面细胞生长过程中数目和活力变化的结论一致，ATCC BHK－21－L细胞株生长速度快，能在较短时间内达到最大细胞密度，是规模化生产口蹄疫疫苗的最佳候选细胞株。

表1 3种细胞比生长速率变化的比较Table 1 The comparison of specific growth rates of three cell lines

2.5 批式培养过程中细胞凋亡率和细胞周期分布变化的比较

由于悬浮培养方式进一步增大了细胞凋亡的比例和几率，成为维持细胞高密度和高活性的重要障碍。2种细胞凋亡率（表2～表4）。在培养至72h，细胞发生了明显的凋亡，随后凋亡率逐增。BHK－21－L细胞在初始培养不仅细胞活性高，细胞也几乎未发生凋亡。而其他2种在培养初期凋亡率较高，但生存维持时间较长。

从细胞周期分布的变化可见，3种细胞变化趋势相同。由于12h的细胞营养丰富，细胞处于快速生长期，DNA合成旺盛，所以S期细胞比例高，但细胞还未分裂，未达到成熟稳定期。随着培养时间延长（48、72、96h），营养物质的消耗，处于 G0／G1期细胞数量显著增加，大部分细胞被阻止在G0／G1期，处于稳定期。但也有少部分细胞继续进行增殖，处于S期和G2／M。不同之处是BHK－21－L细胞株由于生长速度较快，代谢旺盛，在同一培养基下，营养物质缺乏或代谢产物积累过多，在48h～72h已被完全阻止在 G0／G1，细胞不再增殖；而BHK－21－B株和BHK－21C13－2P细胞株继续缓慢生长，在72h～96h才被完全阻止，从而延长了细胞的对数生长期。可见，从细胞周期的分布变化也反映了利用BHK－21－L细胞株悬浮培养能显著缩短细胞的生产周期，更适合于规模化生产。

表2 BHK－21C13－2P细胞株批式培养过程中细胞周期和细胞凋亡率的变化Table 2 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21C13－2Pbatch cultivation

表3 BHK－21－B细胞株批式培养过程中细胞周期和细胞凋亡率的变化Table 3 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21－B batch cultivation

表4 BHK－21－L细胞株批式培养过程中细胞周期和细胞凋亡率的变化Table 4 The changes of cell cycle and apoptosis rate in the process of BHK－21－L batch cultivation

2.6 3种细胞悬浮培养过程中其他特性的比较

在长期的悬浮培养过程中，发现BHK－21C13－2P细胞株极限接种密度为6.0×105个／mL，放大比例为1∶1.5～1∶2，不结团，不贴壁；其它两种细胞极限接种密度为2.0×105个／mL，放大比例1∶5～1∶10，但BHK－21－B细胞株结团较严重。

3 讨论

批式培养是悬浮培养工艺中一种重要的培养方式，具有典型的生长期，即潜伏期、指数生长期、平稳期和衰亡期［5－7］。在本试验中，BHK－21悬浮细胞培养48h细胞达到了最大密度，细胞活性较好，在96%～97%，仅个别细胞发生凋亡；DNA合成旺盛，在48h～72h大部分细胞被完全阻止在G0／G1期，细胞不再增殖；随后，部分细胞逐渐发生凋亡，走向衰亡［8］。这提示我们，在细胞达到指数生长期前需优化培养环境如更换新鲜培养液［9］、降低代谢产物浓度或采取流加培养等措施［10－12］，可使细胞周期继续循环，细胞不断增值。

本试验中3种细胞株在培养特性上各具特色，其中BHK－21C13－2P和BHK－21－B细胞株在镜下观察透亮，细胞状态好；在批式培养过程中具有典型的生长曲线，细胞生长代谢旺盛。但BHK－21C13－2P细胞株初始接种密度要求高，放大比例小，BHK－21－B细胞株在长期培养过程中易出现细胞结团、易贴壁的现象，从而影响细胞的生长。而BHK－21－L细胞株在具有上述2种细胞的优点后，还可达到较高的培养密度，细胞活性值较高，在培养过程中不易结团和贴壁。另外，我们发现BHK－21C13－2P细胞株极限接种密度为6.0×105个／mL，放大比例为1∶1.5～1∶2，不结团，不贴壁；其它两种细胞极限接种密度为2.0×105个／mL，放大比例1∶5～1∶10，但BHK－21－B细胞株结团较严重。本试验比生长速率的变化与前面细胞生长过程中数目和活力变化的结论一致，ATCC BHK－21－L细胞株生长速度快，能在较短时间内达到最大细胞密度，是规模化生产口蹄疫疫苗的候选细胞株。因此，通过上述3种细胞培养特性的比较，BHK－21－L细胞株更适合于规模化生产。

［1］Curz H J，Moreiar L J，Sactey Dias E，et al.The adaptation of BHK cells producing a reombinnat portein to seurm－free media and portein－free medium［J］.Cytotechnology，1998，26（1）：59－64.

［2］陈因良，陈志宏.细胞培养工程［J］.上海：华东化工学院出版社，1992.

［3］Hu W S，Aunins J G.Large－scale mammalian cell culture［J］.Curropin Biotech，1997，8：148.

［4］米 力，陈志南.动物细胞大规模生产蛋白的工艺选择［J］.中国生物工程杂志，2003，3（1）：1－6.

［5］Ray N G.Cultivation of hybridoma cells in continuous：Kinetics of growth and product formation［J］.Biotechnol Bioeng，1989，33：724－730.

［6］Korke R，Rink A，Hu W S.Genomic and proteomic perspectives in cell culture engineering［J］.Biotechnology，2012，94（1）：73－92.

［7］Gambhir A，Europa A F，Hu W S.Alteration of cellular metabolism by consecutive fed－batch cultures of mammalian cells［J］.Biosci Bioeng，1999，87（6）：805－810.

［8］Zhou W C，Rehm J，Hu W S.Alteration of mammalian cell metabolism by dynamic nutrient feeding［J］.Kotechnology，1997，24（2）：99－108.

［9］颜 旭，顾承真，张志强，等.动物细胞灌注培养系统流程及其应用［J］.动物医学进展，2014，35（4）：125－128.

［10］郑朝朝，邱贞娜，李建丽，等.激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（R98株）工艺的研究［J］.中国预防兽医学报，2013，35（2）：107－109.

［11］Cervera L，Gutierrrez Grandos M，et al.Generation of HIV－1 Gag VLPa by transient transfection of HEK293suspension cell culture using an animal－derived component free medium［J］.Biotechnology，2013，166（4）：152－165.

［12］武昱孜，张 旭，华利忠，等.支原体对细胞培养污染的研究概况［J］.动物医学进展，2013，34（9），114－117.