肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对非小细胞肺癌细胞凋亡诱导的实验研究

王建新

[摘要] 目的 研究肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）对非小细胞肺癌肿瘤细胞体外诱导凋亡作用，探讨TRAIL治疗肺癌的可行性。 方法 （1）单用组：单用不同浓度的TRAIL溶液处理A549并与白血病Jurkat细胞对照；（2）联合组：相同浓度的TRAIL联合不同化疗药物处理A549并与对应的单纯化疗药物对照，用MTT法及流式细胞仪检测处理前后A549细胞的凋亡发生率并比较。 结果 TRAIL溶液能使部分体外非小细胞肺癌发生凋亡，TRAIL溶液浓度与细胞凋亡率在一定程度上呈正相关；联合化疗药物后的TRAIL溶液对肿瘤细胞杀灭能力显著强于单用化疗药物组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 TRAIL可诱导小部分非小细胞肺癌细胞体外凋亡，其凋亡作用在一定范围内与TRAIL浓度呈正相关，TRAIL联合常用化疗药物有协同促进肿瘤细胞凋亡的作用。

[关键词] 非小细胞肺癌；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体；凋亡

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）14-0001-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of TNF-related apoptosis inducing ligand （TRAIL） in inducing apoptosis in non-small cell lung cancer， and to explore the feasibility of TRAIL in treatment of lung cancer. Methods The single group： the cells in the two group with solutions of different concentrations of TRAIL A549 and the feasibility of TRAIL treatment between the NSCLC group and the Jurkat leukemia cell group was compared. The combination group： same concentrations of TRAIL combined with different chemotherapy treatment A549 and the corresponding chemotherapy drugs were compared， apoptosis was detected by MTT assay before and after treatment of A549 cells the incidence of parallel statistical comparison. Results TRAIL was able to make part of the non-small cell lung cancer apoptosis in vitro， TRAIL apoptosis rate and concentration had a positive correlation to some extent； TRAIL solution after combination chemotherapy drugs kill tumor cells was significantly stronger ability to eliminate drugs in the chemotherapy alone， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion TRAIL can induce lung cancer cells in vitro， small portion of non-small cell apoptosis of apoptosis within a certain range of concentrations are positively related with TRAIL， TRAIL combined chemotherapy drugs have synergistic apoptosis of tumor cells.

[Key words] Non-small cell lung cancer； Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand； Apoptosis

恶性肿瘤的发病率越来越高，在包括手术切除、放疗、化療等治疗方式但疗效又令人不甚满意的大背景下，需要寻找新的有效治疗的思路和手段。利用肿瘤坏死因子治疗恶性肿瘤是目前研究的热点之一，肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL）是近年来发现的肿瘤坏死因子（TNF）超家族中的又一成员，但与TNF家族成员TNF和FasL的高毒性不同，TRAIL能够选择性的介导多种肿瘤细胞凋亡，却不介导正常细胞凋亡[1]。这一特性使其在肿瘤治疗领域前景广阔，也是近年来研究较热的主要原因。非小细胞肺癌（non-small lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的75%～80%[2]，几乎所有的NSCLC患者在病程的不同时期均需要接受药物化疗，费用昂贵，且有骨髓移植、肝肾功能损害等毒副作用，若能利用TRAIL靶向对抗肿瘤细胞可解决这一难题。本次实验主要研究体外TRAIL试剂对NSCLC细胞株A549的诱导凋亡作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

人NSCLC细胞株A549由哈尔滨医科大学第二附属医院呼吸内科实验室惠赠，人T细胞株Jurkat购于ATCC，顺铂、阿霉素、紫杉醇分别为Bristol-Myers Squibb、Pharmacia&Upjohn、Immunex公司产品，TRAIL溶液购于三博远志生物公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理 细胞解冻后，RPMI1640培养基上传代培养6代，转移分组，每组细胞浓度约为1×105个/mL，观察至对数生长期后，计数细胞浓度后将细胞按每孔1×104个/200 μL接种于96孔板，继续培养24 h。

1.2.2 TRAIL溶液及药物处理 ①单用组：A549细胞贴壁生长后加入新鲜配制的含不同浓度的TRAIL（1、10、100、1000 μg/L）培养液，对照组为同浓度的培养液添加到贴壁生长的Jurkat细胞培养基中，两组均置于37℃ CO2培养箱中24 h；②联合组：联合化疗药物组取含100 μg/L TRAIL的培养液3份9 mL，分别加入阿霉素（5 μmol/L）、顺铂（10 μmol/L）、紫杉醇（5 μmol/L）1 mL，混合后用于培养A549贴壁细胞；单用化疗药物组为不含TRAIL的培养液加入上述3种同等浓度剂量的药物后，培养A549贴壁细胞，均置于37℃ CO2培养箱中培养24 h。

1.2.3 细胞活性检测 每个培养基均分为两组，一组用MTT法测定细胞活性，另一组用流式细胞仪测定凋亡率，分别取上述每个培养基中细胞1×106个，经pH 7.4、0.01 mol/L的PBS溶液洗涤后，70%低温乙醇4℃固定48 h，采用MTT法测定细胞活性；另一组经上述洗涤、固定、并行碘丙啶染色后，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3 统计学处理

结果均由3次重复实验获得，采用SPSS 18.0软件包进行统计学处理，计量资料以（x±s）形式表示，采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

MTT法与流式细胞仪检测细胞活性统计结果表现一致，存在线性相关，与同类统计相符，说明此次统计结果可靠。

2.1 单用组两组细胞凋亡率比较

单用组A549细胞总体凋亡率低于白血病Jurkat细胞，随着TRAIL浓度的升高，NSCLC细胞凋亡也升高，在一定程度上呈正相关，见图1、2。

2.2 联合组两组细胞凋亡结果比较

TRAIL联合化疗药物处理A549细胞株与单用化疗药物组相比，细胞凋亡率更高，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

3 讨论

人类TRAIL基因定位于3号染色体的3q26，其mRNA广泛表达于外周血单核细胞（PBMC）、肺、卵巢、肠管等多种器官组织中，但不表达于人脑、肝脏和睾丸[3]。TRAIL是由281个氨基酸组成的典型Ⅱ型跨膜蛋白，其N端（胞内区域）没有信号肽，第15～40位氨基酸为疏水区域，形成跨膜结构，胞外C末端的114～281位氨基酸为其活性部位，机体内的蛋白酶能够将这部分胞外氨基酸链水解成可溶性单体，可溶性单体可与TRAIL受体结合，发挥生物效能。

提及TRAIL受体，目前发现的人TRAIL受体共5个，包括4个非可溶性细胞膜受体（2个死亡受体、2个诱骗受体）和1个可溶性受体[4]。2个死亡受体分别是死亡受体4（death receptor 4，DR4）和死亡受体5（DR5），均为Ⅰ型跨膜蛋白，上文所述的TRAIL胞外氨基酸被蛋白酶水解为可溶性单体，3个可溶性单体通过Cys230螯合一个锌离子，形成有活性的同源三聚体，同源三聚体可与DR4/DR5结合，进而诱导细胞凋亡。

有研究用Northern杂交发现[5]，两种死亡受体DR4/DR5 mRNA的组织表达范围与TRAIL相似；并且国内王绩英等[6]的实验证实，在非小细胞肺癌组织中DR4、DR5均为阳性表达。这两项实验结果的发现为TRAIL治疗恶性肿瘤，特别是对抗非小细胞肺癌奠定了生物学基础。本次实验单用组结果：TRAIL体外诱导非小细胞肺癌凋亡，总凋亡率低于对白血病Jurket细胞的凋亡率。白血病Jurket细胞TRAIL死亡受体的阳性表达，在TRAIL研究领域已是共识，这也是众多研究TRAIL诱导恶性肿瘤凋亡实验选用Jurket细胞作为对照的原因所在。分析实验结果，体外环境下NSCLC细胞对TRAIL的敏感性不及Jurkat细胞，原因可能有以下3点：①两种细胞死亡受体表达程度不同[7]，Jurkat细胞DR4、DR5的表达率高于NSCLC细胞；②两者均在体外实施诱导实验，TRAIL诱导两者体内凋亡对内环境的需求至今尚未阐明，若存在需求不同，而体外为同一环境，可能存在对两者凋亡的不平衡性因素；③NSCLC细胞为实体肿瘤组织细胞，人白血病Jurkat为非实体肿瘤细胞，两者本身特性及生存能力存在差异[8]。

實体肿瘤细胞凋亡信号传导有两种主要方式：一是前文所述的死亡受体途径，另一个是线粒体途径。临床上常见的经典抗肿瘤药物作用机制主要涉及线粒体途径。但是这两种信号途径并不完全独立，Caspase的序贯激活是细胞凋亡的特征性变化[9]，Caspase存在多种亚型，功能不一，Caspase8、Caspase10是启动型，Caspase3、Caspase6为效应型代表，其中在细胞凋亡过程中，效应型Caspase3作用最为重要，它是死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径中多种Caspase的共同底物[10]，联合两种途径的同时酶切及几乎所有的胞内结构蛋白，保证凋亡的不可逆转性。施敏骅等[11]的实验证实抗肿瘤药物处理后的NSCLC细胞中Caspase3活性在基础水平上有明显提高，且有浓度依赖关系。本次实验中联用组结果显示，采用TRAIL联合常用肿瘤药物处理NSCLC细胞凋亡率明显高于单用抗肿瘤药物处理的结果，差异有统计学意义（P<0.05）。其原因可能是TRAIL与抗肿瘤药物通过两种途径分别激活不同的Caspase，并级联合放大有关凋亡信号，因而对肿瘤细胞凋亡产生了更为强烈的协同作用[12]。这是研究者们所期待的，也是TRAIL在抗肿瘤领域应用前景广阔的原因所在。本次实验旨在研究TRAIL对肿瘤细胞的凋亡作用，对不同种类抗肿瘤药物作用结果的不同未作统计学对比及阐述。

综上所述，本研究结果显示TRAIL能够在体外诱导部分NSCLC细胞凋亡，并与常用的抗肿瘤药物存在协同关系。但毕竟是体外实验，体内内环境的复杂性对TRAIL选择性杀伤NSCLC细胞有何影响还有待阐述，但有利的是NSCLC细胞存在允许TRAIL发挥凋亡作用的死亡受体，并且TRAIL与抗肿瘤药物在对抗肿瘤方面有协同作用。这些特性使TRAIL有望在靶向治疗NSCLC及耐药性NSCLC[13]方面取得突破。

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[11] 施敏骅，余勇，钱斌，等. TRAIL和抗肿瘤药物协同诱导非小细胞肺癌凋亡的实验研究[J]. 苏州大学学报：医学版，2006，26（2）：190-192.

[12] Kim C Y，Jeong M，Mushiake H，et al. Cancer gene therapy using a novel secretable trimeric TRAIL[J]. Genetherapy，2005，13（4）：330-338.

[13] 吳国明，范晔. 晚期非小细胞肺癌靶向治疗研究进展及思考[J]. 西部医学，2012，24（1）：1-4.

（收稿日期：2014-11-04）