应用实时荧光RT—PCR法检测水产品中诺如病毒
2015-05-30纪衍瑾孙雯雯祝喆杨松涛
纪衍瑾 孙雯雯 祝喆 杨松涛
[摘要] 目的 建立水产品样品中的诺如病毒检测方法。 方法 优化甘氨酸缓冲液处理水产品匀浆液，摸索PEG沉淀浓缩病毒的浓度，提取病毒RNA，采用荧光定量RT-PCR方法进行诺如病毒检测。 结果 应用优化后的方法检测72份样品，并用核苷酸序列测定法对阳性PCR产物进行验证，所得阳性PCR产物经核苷酸序列测序证实为诺如病毒。 结论 本研究方法可以应用于水产品中的诺如病毒检测，抚顺市海鲜市场上的水产品很少存在诺如病毒的污染。
[关键词] 诺如病毒；水产品；富集；荧光定量RT-PCR
[中图分类号] R450 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2015）19-0130-03
诺如病毒（norovirus，NoV）是引起儿童急性胃肠炎的主要诱因，可出现食物腹泻、呕吐、头痛、腹痛和发热等中毒症状，在世界公共卫生安全中严重威胁着人类的生命安全[1]。最初，在检测诺如病毒的过程中，检测方法有很大的局限性，人们对诺如病毒对人类所能造成的影响和危害缺少正确的认识，并且低估了诺如病毒所能造成的危害性。
诺如病毒属于人类杯状病毒科，呈球形，无包膜，可通过人-人直接接触传播、食物性传播（生吃海产品尤为主要）、水源性传播等多种传播途径传播[3]。诺如病毒有高度的变异性，在同一时期、同一地区就可能存在不同遗传特性的毒株。诺如病毒抗体保护力弱，不能实现长期免疫保护，所以非常易造成反复感染。食品和饮料很容易被诺如病毒感染，100个病毒就能造成人们发病。诺如病毒在体外很难繁殖，如果一遇到食品和水，极易引起人们发病。当人们生食或食用加热不彻底的贝类时，也可能受到感染，近年来有很多外国媒体已报道，许多胃肠炎暴发疫情都与生吃牡蛎等贝类食物有关[3，4]。另外，有些产品比如色拉和冰冻水果也可能在来源地被污染，进而引起人们发病。2012年，德国有1万多名小学生和托儿所的儿童在学校疑似吃了中国进口的冷冻草莓而发生食物中毒。后来，由罗勃特科赫研究院在一包草莓样品中检测到可引起非细菌性胃肠炎的诺如病毒[5]。由于诺如病毒在食物中含量很低，因此，在检测各类样品时，还应考虑到诺如病毒感染样品的复杂性、病毒的高度变异性和混合感染等因素，尤其是在对蛋白、脂类等PCR反应抑制物含量高的食品样品的前处理上以及检测混合感染的细菌或其它病毒、浓缩低含量样品、降低假阳性率等方面要多加注意，确保实验结果的科学性和可靠性[6-8]。
1 材料与方法
1.1样品的运输与保存
标本采集后确保在2 h内完成转运，运输过程中使用冰袋进行冷藏，使样品所处温度在0℃～5℃。病毒在4℃保存不可超过3 d，因而实验室收到样品后应尽快进行检测，如不能及时进行检测，需将样品置于-20℃保存，如能置于-70℃超低温冰箱中冷冻保存最好。
1.2 仪器与试剂
NuAire NU425-400E Ⅱ级生物安全柜（美国），贝克曼Microfuge22R冷冻离心机（美国），ABI 7500Fast全自动实时荧光定量PCR仪（美国），海尔低温冰箱，Heidolph漩涡振荡器（德国），RNeasy Mini Kit核酸提取盒（德国QIAGEN公司），1.5 mL无核酸离心管，甘氨酸缓冲液，PEG8000，组织匀浆器（美国Thremo公司），100～1000 μL可调移液器。
1.3病毒提取的预处理（病毒的富集）
无菌取样，在5 g检样中加入35 mL甘氨酸缓冲液（样品重量与缓冲液体积之比为1∶7）；组织匀浆器中高速匀浆3 min，充分破碎混匀；将所有均质液转移到50 mL离心管中，37℃孵育30 min或室温下振荡30 min；4℃，10000×g离心30 min；取上清，加入10 mL氯仿，充分振摇，放置10 min，中间振摇一次，4℃，10000×g离心30 min；取上清至另一清洁的100 mL离心管中，加入等体积的PEG 8000溶液（PEG终浓度为8%），上下颠倒离心管以充分混匀；冰浴：冰上放置至少1 h，4℃，10000×g離心5 min。弃去上清，保留沉淀。
1.4 实时荧光RT-PCR反应体系
本实验采用实时荧光RT-PCR方法进行检测，RT-PCR 反应体系采用中山达安基因生物公司的商品化病毒核酸检测试剂盒（PCR荧光探针法GⅡ型），PCR反应操作流程严格按照试剂盒使用说明书进行。本试剂盒适用于诺沃克病毒GⅡ型的病毒核酸检测。体系配制参考试剂说明书。反应条件：50℃，15 min，1个循环→95℃，15 min，1个循环→94℃，15 s，55℃，45 s（收集荧光），45个循环。
1.5 判定标准
以试剂提供的诺如病毒阳性质控品为阳性对照，以试剂提供的阴性质控品作为阴性对照。所检测样品的Ct值≤30时，且扩增曲线有明显对数增长期，则测定结果有效，可直接报告样品为阳性；若30
2 结果
通过检测2014年1～12月期间抚顺市各水产品经销处贝类样品72份，对实时荧光PCR反应结果进行分析，可以发现阳性对照的Ct值为19且曲线有明显对数增长期，而所采集的样品的检测结果均无扩增曲线，所采集样品中未发现GⅡ型诺如病毒呈阳性的样品。以1月份所采集样品的PCR检测结果为例见图1，检测数据见表1。
图1 2014年1月所采集样品检的测结果
将该方法应用于2014年1～12月从抚顺市海鲜市场上购买的72份海产品（包括牡蛎46份、生蚝10份、扇贝8份、蛏子8份）样本检测，所检测样品中无GⅡ型诺如病毒阳性样品，阳性对照有明显的扩增曲线，说明该方法可应用于海产品样品中诺如病毒的核酸检测，也提示抚顺市海鲜市场上的海产品很少存在诺如病毒的污染。
3 讨论
诺如病毒可通过多种途径传播，是成人、婴幼儿以及儿童发生急性胃肠炎的主要病原之一[6]。“诺如病毒”感染性腹泻属于自限性疾病，没有疫苗和特效药物，公众搞好个人卫生、食品卫生和饮水卫生是预防本病的关键，要养成勤洗手、不喝生水、生熟食物分开、避免交叉污染等健康生活习惯。目前，科学家已对上百种诺如病毒进行基因测序[9]。本研究结果表明，出现的地区不同，流行时间不同的诺如病毒基因序列比较保守一些。许多流行病学研究提示GⅡ型诺如病毒在急性胃肠炎感染中占主要地位，并且GⅡ4型为最常见，而GⅡ4/2006b型是目前的流行株[10-12]。
Jiang X的研究团队在1992年成功研究出检测诺如病毒的RT-PCR方法。目前诺如病毒的检测方法主要是ELISA法、常规RT-PCR法和实时荧光定量RT-PCR法[13]。如今，常规RT-PCR技术易于操作，灵敏度较高，是目前检测诺如病毒应用最广泛的方法，被称为检测诺如病毒的“金标准”。有学者所用引物为RNA多聚酶区的JV12/JV13，并对模拟水样进行检测。结果表明，RT-PCR产物长度为327 bp，在模拟水样中检测灵敏度为200 ng/L，该实验所建立的方法对水质控制起到了很好的监测作用。目前，运用ELISA法已上市的诺如病毒检测试剂盒有IDEIATM Norovirus 试剂盒、Ridascreen Norovirus等。试剂盒相对于PCR技术更加简单方便，但由于存在抗体抗原的特异性，该方法可能出现假阳性或假阴性结果[14，15]。实时荧光RT-PCR技术敏感性较高，较常规RT-PCR省时，逐渐取代了常规PCR技术。同时，也可用于监测水体及贝类中的诺如病毒，保障公共食品卫生安全。
本次实际样本的检测全部为诺如病毒阴性，可能是海产品带毒率低，也可能与采样的时间、采样温度及样品量有关，需要我们进一步进行系统监测，以深入了解诺如病毒的分子流行病学特征，传播的来源、途径及污染的高危食物，为预防和控制诺如病毒的爆发和流行提供科学依据。
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（收稿日期：2015-04-02）
