关节液TNF—α和TGF—β1检测在膝骨性关节炎中的应用

陈明 王丹娜 高福明 汪官富 管敏昌 朱让腾 郑有卯 应有荣

[摘要] 目的 探讨膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）患者关节液TNF-α和TGF-β1水平变化及其临床意义。方法 选择我科住院90例KOA患者，依据X线影像分期分为早期患者30例（A组），中期患者30例（B组），晚期患者30例（C组）；健康志愿者30例为对照组。对四组患者关节液TNF-α和TGF-β1水平进行检测。 结果KOA中、晚期关节液TGF-β1水平明显低于对照组（P<0.01）；KOA中、晚期关节液TNF-α水平明显高于对照组（P<0.01）；KOA早期关节液TNF-α和TGF-β1水平与对照组比较，无统计学意义（P>0.05）；而KOA早、中、晚期关节液TNF-α/TGF-β1水平明显高于对照组（P<0.01）；TNF-α与KOA分期呈正相关（r=0.930，P<0.01）；TGF-β1与KOA分期呈负相关（r=-0.849，P<0.01）；TNF-α/TGF-β1与KOA分期呈正相关（r=0.828，P<0.01）。 结论 TNF-α和TGF-β1参与了KOA的形成和进展，关节液NF-α和TGF-β1水平能反映KOA的病变严重程度；关节液TNF-α/TGF-β1能早期发现KOA。

[关键词] 膝骨性关节炎；关节液；X线影像分期；TNF-α；TGF-β1

[中图分类号] R274.9；R816.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）19-0022-04

KOA又名增生性骨关节炎，是一种以中老年关节软骨的变性、破坏、骨质增生为特征的慢性进行性骨关节疾病，以膝关节最为常见。流行病学调查显示[1]，50% 的65 岁以上人群、85%的75 岁以上人群患有KOA。随着人口老龄化程度的加剧，KOA 将会对患者、家庭及社会造成更大的影響。KOA尚无特效的药物，早期发现并采用有效干预措施显得尤为重要。现代医学发现[2]，细胞因子是参与KOA进程的重要介质。KOA通常从关节软骨退化开始，继而发生骨质和滑膜改变。由于KOA早期 X 线征象不明显，关节滑液特异性分子在KOA的发病中具有重要作用，检测关节液特异性分子水平能间接反映关节软骨代谢状况，并可能成为KOA早期诊断的有效方法。KOA 的病因及发病机制尚不明确，本研究通过检测KOA患者早期、中期和晚期关节液中的TNF-α和TGF-β1浓度变化，探索关节液TNF-α和TGF-β1水平，早期发现KOA。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2009年4月～2013年4月我院骨科确诊KOA早期患者30例作为A组，其中，男17例，女13例，年龄（69.37±13.84）岁；KOA中期患者30例作为B组，其中，男16例，女14例，年龄（68.28±12.04）岁；KOA晚期患者30例作为C组，其中，男16例，女14例，年龄（68.28±11.75）岁；健康志愿者30例为对照组，其中，男13例，女17例，年龄（68.66±12.97）岁。四组性别、年龄经统计学处理无统计学意义（P>0.05）。

1.2 KOA诊断标准[3]

参照中华医学会骨科学分会2007年制定的KOA诊断标准：①1个月内多数时间有膝痛；②关节活动响声；③晨僵 30 min；④年龄>40岁；⑤膝关节骨性肿胀伴弹响；⑥膝关节骨性肿胀不伴有弹响。至少存在①、②、③、④或①、②、③、⑤或①、⑥即可诊断KOA。

1.3 排除标准

①排除风湿性、类风湿疾病、痛风、肝肾疾病、内分泌或代谢性关节病以及其他特异性关节疾病[4]；②6个月内接受过膝关节腔穿刺、注射或手术等治疗；③关节内肿瘤及化疗者；④近8周内接受过糖皮质激素、非甾体类抗炎药、炎症因子抑制剂治疗[5]；⑤近8周内有局部关节感染史；⑥未签署知情同意书者。

1.4 KOA的分期

采用Kellgren-Lawrence（K-L）分类法[6]将KOA分为6级。按KOA进程分为早、中、晚期，其中早期KOA的X线影像诊断为0～1级；中期KOA的 X线影像诊断为2～3级；晚期KOA的X线为4～6级。

1.5 ELISA检测关节液中TGF-β1和TNF-α含量

所有受试对象局麻下抽取右侧膝关节液2 mL，收集关节液置于试管中，4℃，4 000 r/min，离心10 min，取上清液保存于-80℃低温冰箱中待测。TNF-α、TGF-β1采用酶联免疫吸附法（ELISA），分别采用北京碧橙蓝生物科技有限责任公司和晶美生物技术北京有限公司生产的ELISA试剂盒，操作过程严格按说明书进行操作。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），均数两两比较采用LSD法，P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组患者关节液中TGF-β1和TNF-α水平比较

KOA早期患者关节液TGF-β1与对照组比较，差异无显著性（t=1.826，P>0.05）；KOA中、晚期患者关节液TGF-β1与对照组比较，差异有统计学意义（t=8.838、18.878，P<0.01）；KOA早期患者关节液TNF-α水平与对照组比较，差异无统计学意义（t=1.973，P>0.05）；KOA中、晚期患者关节液TNF-α水平与对照组比较，差异有统计学意义（t=43.886、53.301，P<0.01）；KOA早、中、晚期患者关节液TNF-α/TGF-β1与对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。

表1 四组患者关节液TGF-β1和TNF-α水平比较（x±s，n=30）

注：*与对照组比较，P>0.05

2.2 四组KOA患者关节液中TGF-β1和TNF-α水平与KOA分期相关性

KOA患者关节液中TGF-β1水平与KOA分期呈负相关（r=-0.849，P<0.01）；关节液中TNF-α水平与KOA的分期呈正相关（r=0.930，P<0.01）；关节液中TNF-α/TGF-β1与KOA的分期呈正相关（r=0.828，P<0.01）。

3 讨论

据文献报道[7]，60 岁以上的人群中，50%在X 线片上有KOA的表现，75 岁以上的人群中，80%有OA的症状。近年来，KOA发病率呈上升趋势，严重影响着人们的身体健康和生活质量。目前 KOA的诊断主要根据临床症状、体征、X 线、磁共振检查等。X线改变是KOA 的重要病理特征，KOA的病理改变主要以关节软骨的变性、破坏、骨质增生为主，X线改变是判断OA的客观指标，但早期缺乏特异性和灵敏性[8]。因此，发现一些特异性、敏感性高的标志物，可早期发现并诊断和防治KOA，并延缓或预防已病变的关节软骨退变的进一步进展。动物实验显示[8]，炎症因子随着KOA症状的加重明显升高，说明了炎症因子对于判断KOA的严重程度是很有价值的。临床研究也发现[9]，KOA发病时血清及关节液的炎性因子水平明显增加，并进一步提出多种细胞因子和炎症介质可能参与了KOA的发生、发展和预后的病理过程。细胞因子和炎症介质日益受到国内外学者的重视，但炎症介质与KOA严重程度关系却鲜见报道。

TNF-α是一种多功能的炎性细胞因子，主要由单核巨噬细胞产生。有研究显示[10]，KOA患者外周血TNF-α水平较健康者显著升高，并且KOA病情与患者外周血TNF-α水平呈正相关。也有研究显示[11] KOA中、晚期患者关节液中的TNF-α水平与KOA分期呈显著正相关。有学者推测[12]，TNF-α可能通过自分泌和旁分泌形式作用于软骨细胞，使软骨基质的降解；同时TNF-α可刺激滑膜成纤维细胞和软骨细胞产生包括MMP在内的炎性递质的分泌，从而降解关节软骨蛋白多糖和胶原。本研究也发现KOA患者中期和晚期关节液中TNF-α浓度分别与健康对照组比较，差异有显著性（t=43.886、53.301，P<0.01）。直线回归分析显示，KOA分期与关节液中TNF-α呈显著正相关（r=0.930，P<0.01）；进一步证明TNF-α是参与KOA的主要细胞因子，TNF-α可能在KOA发病机制中起着极其重要作用。推测TNF-α通过与软骨细胞膜上TNF-α受体发生结合，通过趋化、激活滑膜巨噬细胞，进一步分化为破骨细胞，导致边缘骨质的破坏，抑制基质的修复；同时干扰软骨正常代谢加快软骨基质的降解，促进关节软骨的破坏。但KOA早期TNF-α水平与健康对照组无显著差异（t=1.973，P>0.05），提示关节液单独TNF-α水平仍不能早期發现KOA。

TGF-β是一种多功能调节因子，可以调节细胞增殖、分化、基质合成以及细胞凋亡。TGF-β1是TGF-β家族中目前研究较多的一种。有研究报道[13]，TGF-β1具有对致炎作用的炎性介质如IL-1、TNF-α产生拮抗作用，从而促进软骨的修复及抑制软骨的退变。也有研究发现[14]KOA患者无论在蛋白还是在mRNA水平均能够负性调节MMP-13的表达，提示TGF-β1在一定程度上可反映膝关节病理的严重程度。本研究显示，KOA患者中、晚期关节液中TGF-β1水平高于健康对照组（t=8.838、18.878，P<0.01），直线回归分析显示，KOA分期与关节液中TGF-β1呈显著负相关（r= -0.849，P<0.01），与相关文献报道一致[14]。提示随着X线分期逐步升高，TGF-β1水平明显下降，提示TGF-β1是影响KOA病程的主要炎症介质之一。也有专家认为，TGF-β1加快了蛋白多糖的代谢，并刺激胶原和葡糖胺聚糖在关节软骨中的合成[15]；另一方面TGF-β1通过抑制MMP的产生以及促进IMP的合成与分泌，参与软骨损伤修复[16]。因此，TGF-β1逐渐减少可能是KOA发生的根源之一，关节液TGF-β1水平检测有可能成为衡量KOA病情另一个重要指标。但TGF-β1水平KOA早期与健康对照组无显著差异（t=1.826，P>0.05），提示关节液单独TGF-β1水平仍不能早期发现KOA。

本研究还显示，KOA早、中、晚期TNF-α/ TGF-β1均显著高于健康对照组（P<0.01），直线回归分析显示，KOA分期与TNF-α/TGF-β1呈显著正相关（r=0.828，P<0.01），这是否意味着TNF-α/ TGF-β1能早期发现KOA，并在一定程度上更能敏感地反映了KOA病程和病情严重程度。深入研究KOA患者关节液中TGF-β1、TNF-α表达水平对研究KOA发病机制具有理论指导意义。

综上所述，关节液TNF-α水平增加和TGF-β1水平减少可能是KOA关节损害的中心环节，而TNF-α/TGF-β1可能是早期发现KOA敏感指标之一。动态检测KOA患者关节液中TGF-β1、TNF-α及TNF-α/ TGF-β1水平变化可能对评估病情严重程度与早期病程判断具有重要临床意义。

[参考文献]

[1] 刘强，洪加源，胡维界. 膝骨性关节炎治疗进展[J]. 医学综述，2015，21（3）：474-476.

[2] 张林，陆军，李永刚. 骨关节炎中介导软骨细胞代谢失衡的相关信号通路研究进展[J]. 东南大学学报（医学版），2013，32（4）：465-472.

[3] 张文超. 臭氧注射治疗对膝骨性关节炎患者关节滑液中NO 和MMP-9 含量的影响[J]. 放射免疫学杂志，2013， 26（4）：499-500.

[4] 郭彩蓉，熊辉明. 膝骨性关节炎患者治疗前后血清超敏C 反应蛋白、白介素-1β、白介素-6 和肿瘤坏死因子-α水平的变化[J]. 中国现代医生，2014，52（17）：79-81.

[5] 郑功胜，陈成然，何定锋，等. 透明质酸钠对膝骨性关节炎患者血清基质金属蛋白酶-9、12和13水平的影响及疗效观察[J]. 中国现代医生，2015，53（3）：16-22.

[6] 闫立，梁朝，温建民，等. 六步理筋手法治疗早期髕股关节骨性关节炎[J]. 中国中医骨伤科杂志，2013，21（1）：28-30.

[7] 田文博. 输液式关节腔冲洗加玻璃酸钠注射治疗膝关节骨性关节炎60 例疗效分析[J]. 中国现代医生，2013， 51（9）：154-155.

[8] 陈根强，许慧娟，汪志明，等. 骨性关节炎患者中血清与关节液的炎性因子水平变化及意义[J]. 武汉大学学报（医学版），2014，35（1）：110-113.

[9] 吴大鹏，刘晓谭，杨林，等. 血浆及关节滑液中结缔组织生长因子水平与膝关节骨性关节炎严重程度的相关性[J].新乡医学院学报2013，30（8）：641-644.

[10] 刘一峰，郑义华，杨义雄，等. 温针对大鼠膝骨性关节炎关节液和血清IL-1β、TNF-α 的影响[J]. 福建中医药大学学报，2011，21（3）：34-35.

[11] 林睿，高灿，胡永挑，等. NO、TNF-α在骨性关节炎病程中的作用[J]. 放射免疫学杂志，2011，24（3）：351-352.

[12] 王会仁，程飚. 骨性关节炎滑膜病变的研究进展[J]. 中华临床医师杂志（电子版），2010，4（10）：1932-1934.

[13] 张平，蔡道章，刘斌，等. 转IL-1Ra 和TGF-β1 基因治疗兔骨性关节炎的体外实验研究[J]. 中华关节外科杂志（电子版），2011，5（3）：335-342.

[14] 郭静，李琪佳. 基质金属蛋白酶13和转化生长因子β1 mRNA及蛋白在骨性关节炎中的表达[J]. 第四军医大学学报，2009，30（22）：2626-2629.

[15] 周斌，樊粤光，曾意荣. 中药关节康对骨性关节炎软骨TGF-β1、IL-1β表达的影响[J]. 中国中医骨伤科杂志，2009，17（2）：11-13.

[16] 张艳玲，武永利，闫安，等. 温针灸对膝骨性关节炎患者血清中IGF-1、TGF-β和 FGF-2 表达水平影响的研究[J]. 宁夏医科大学学报，2013，35（2）：177-180.

（收稿日期：2015-03-10）