皮肤病理性瘢痕及Smad蛋白和基因的表达情况

2015-05-30张艳胜嵇冰

中国现代医生 2015年19期

张艳胜嵇冰

[摘要] 目的观察皮肤病理性瘢痕及Smad蛋白和基因的表达情况。方法所有标本来源于2010年4月～2014年4月在我院行瘢痕切除患者和招募的正常志愿者共136例，其中瘢痕疙瘩组47例，增生性瘢痕组44例，正常皮肤组共45例，对所有标本行RT-PCR及流式细胞学检测并分析检测结果。结果从Smad3、TGF-β1基因及其表达情况来看，瘢痕疙瘩组和增生性瘢痕组均高于正常皮肤组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Smad3和TGF-β1的表达是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的重要特征。

[关键词] 病理性瘢痕；皮肤；Smad；TGF-β1

[中图分类号] R622 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）19-0008-04

病理性瘢痕是皮肤常见的疾病之一，是创伤后机体异常修复的结果，根据临床症状的不同，分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。病理性瘢痕的发生与成纤维细胞的异常增生、胶原蛋白的大量沉积有关，体外实验证实TGF-β1/Smad信号通路对成纤维细胞的增殖、胶原蛋白的合成有重要作用，但是对于病理性瘢痕的活体标本研究报道并不多，因此本研究拟对皮肤病理性瘢痕的TGF-β1/Smad信号通路中的关键分子进行检测观察，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

所有标本来源于2010年4月～2014年4月在我院行瘢痕切除患者和招募的正常人共136例，其中男70例，女66例，年龄34～48岁，（41.11±6.74）岁，标本来源的部位分别为头面部38例，上肢60例，下肢38例。瘢痕疙瘩组47例，男26例，女21例，年龄35～48岁，（40.87±6.81）岁，标本来源的部位分别是头面部11例，上肢23例，下肢13例；增生性瘢痕组44例，男21例，女23例，年龄34～48岁，（41.57±6.99）岁，标本来源的部位分别是头面部13例，上肢18例，下肢13例；正常皮肤组共45例，男23例，女22例，年龄35～48岁，（41.03±6.41）岁，标本来源的部位分别是头面部14例，上肢19例，下肢12例。所有患者病例資料完整，知情同意参加研究，医院伦理委员会批准通过。纳入标准：①符合病理性瘢痕诊断标准。②患者无其他皮肤疾病。③患者无严重器质性病变。排除标准：①年龄大于60岁的患者。②不能配合瘢痕切除或皮肤取材的患者。③使用免疫抑制剂、激素患者。④使用放射性治疗、化疗患者。

1.2 病理性瘢痕诊断标准[1]

①瘢痕疙瘩是在皮肤受损修复时，瘢痕生长范围超过皮损范围，向四周皮肤持续性浸润生长，发病超过12个月，有高于表皮的规则皮肤赘生物，蟹足状生长，有痒和刺痛感。②增生性瘢痕是严重烧伤皮肤愈合期，皮肤局部增生隆起，质地较韧，形态不规则，伴疼痛感。③样品均常规苏木精-伊红染色切片，并由两位病理主治医师阅片确诊。

1.3方法

1.3.1 RT-PCR 试剂准备：①基因组DNA 提取试剂盒（Promega 公司）；②PCR产物纯化试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；③质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；④脱氧核糖核酸、Pfu 酶（上海生工生物工程有限公司）。将500 μL Trizol试剂（Invtrogene公司）和100 μL氯仿加入100 mg组织样品，混匀后离心，速度为14000 r/min，时间为10 min，离心后取上层水相，移至新EP 管后加入同等体积沉淀RNA，去上清液，精置干燥后加入10 μL去离子水溶解RNA，最后使用DEPC 处理，-80℃保存。Real-Time PCR操作按照试剂盒说明书进行，GAPDH作为内参，95℃预变性15 min；95℃变性40 s，62℃退火，72℃延伸60 s，共进行35 个循环，PCR产物长度为800 bp。扩增Ct值的分析采用lightcycler 荧光定量PCR仪配备软件。采用正常皮肤组的ΔCt值校正，根据2-ΔΔCT 数值计算得出检测指标。RT-PCR的引物设计根据国例Smad、TGF-β1基因片段的保守性区域以及GenBank 中Smad 基因碱基序列进行，Smad、TGF-β1基因为 5'-CGCTTGATCCAAAGTGGAAT-3'，5'-GGTTGATGGCATTGGAAAGA-3'；TGF-β1为5"-GGACTACTACGCCAAAGAAG-3，5-TCAAAAGA-CAGCCACTCAGG-3；GAPDH为5'-ACTTAGTTG-CGTTACACCCTTTCT-3'，5'-TTCATACATCTCAAGT-TGGGGGAC-3'。

1.3.2 流式细胞仪半定量检测半定量检测Smad3和TGF-β1的表达产物：使用体积分数70%的乙醇固定适量冻存的组织标本，将标本放于120目不锈钢网上面，其下放置一个平皿，将组织剪碎，使用眼科镊轻柔地搓组织标本块，同时使用0.9%NaCl溶液冲洗，直到搓完组织。使用300目铜网过滤平皿中的混悬液，将细胞团块去除，将细胞悬液倒入离心管，进行离心，速度为800 r/min，时间为2 min，离心结束后去除上清液。向离心管内加入 1mLPBS溶液重悬细胞，显微镜下计数，稀释细胞液，直到浓度为1×109/L。取稀释后的细胞悬液0.1 mL，加入0.1 mL Smad3或TGF-β1工作液，常温孵育30 min。孵育结束后加入10 mLPBS溶液洗涤，去除上清液，加入100 μL FITC-IgG二抗工作液，避光常温孵育30 min，加入10 mL PBS溶液，离心条件同上，去除上清液。加入0.1 mL PBS溶液，使用500目铜网过滤溶液，最后使用流式细胞仪检测，操作步骤按照标准操作规范进行，操作结束后应用 Expo 32 ADC数据分析。

1.4 观察指标[2]

观察三组患者组织标本的Smad3及TGF-β1的基因及其表达产物的大小。

1.5统计学方法

所有数据采用 SPSS20.0统计学软件分析，计量资料用（x±s）表示，采用t检验；计数资料用n（%）表示，采用χ2检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组患者Smad3和TGF-β1的RT-PCR结果

瘢痕疙瘩组Smad3、TGF-β1的基因表达水平均高于正常皮肤组，增生性瘢痕组的Smad3、TGF-β1的基因表达水平同样高于正常皮肤组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 三组患者Smad3和TGF-β1的RT-PCR结果（x±s，μmol/L）

注：瘢痕疙瘩组与正常皮肤组相比，1）P<0.05；增生性瘢痕组与正常皮肤组相比，2）P<0.05

2.2三组患者的Smad3和TGF-β1 流式细胞仪结果

瘢痕疙瘩组的Smad3、TGF-β1的含量均高于正常皮肤组，增生性瘢痕组的Smad3、TGF-β1的含量同样高于正常皮肤组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

表2 三组患者的Smad3和TGF-β1的流式细胞仪结果（x±s）

注：瘢痕疙瘩组与正常皮肤组相比，1）P<0.05；增生性瘢痕组与正常皮肤组相比，2）P<0.05

3 讨论

瘢痕是由各种创伤发生后，处于愈合状态的皮肤组织的外观形态和组织病理学改变的统称[3]。创伤的愈合长久以来都是医学最为关注的问题之一，创伤的愈合由三个阶段组成，即炎症反应期、细胞增殖期、瘢痕形成/组织重塑期[4]。因此，瘢痕是正常组织损伤修复的过程，一般来说是无法避免的，大部分瘢痕形成的结果是出现生理性瘢痕，是指细小、平整、颜色接近周围皮肤的瘢痕，如果形成的瘢痕大、凹凸不平、突出皮肤表面、颜色明显不同于周围皮肤则称为病理性瘢痕。病理性瘢痕的发生率为4%～6%，临床上，根据病理性瘢痕的不同，又分为增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。增生性瘢痕表现为外形排列不规则，突出局部皮肤表面，瘢痕颜色潮红，质地实韧，或呈波浪形，或成绳索状，有烧灼痛、痒感，大多发生在深度烧伤的创面愈合后。而瘢痕疙瘩表现为瘢痕过度生长，明显超出原局部创伤范围，呈蟹足状增生并且侵犯周围组织，不进行医学干预不会消失，单纯手术切除极易复发[5]。瘢痕疙瘩几乎可以发生在所有的人种中，但是不同人种的发病率还是有所差异，其中黑种人发病率是白种人的15倍，而黄种人的发病率也比白种人高[6]。虽然瘢痕的形成是创伤修复的正常过程，是一种自我保护的表现，但是过度增生而形成的病理性瘢痕对患者带来巨大的痛苦，尤其是皮肤发生病理性瘢痕，往往无法达到完美的治疗修复，外观的改变使患者自觉难以融入社会交往，同时，病理性瘢痕更是一种癌前病变，癌变率高达1%～2%，癌变潜伏期可为3 个月至数年或数十年，因此病理性瘢痕对于患者的身心影响是巨大的 [7，8]。

从临床上观察，病理性瘢痕的好发部位主要有前胸、后背部、耳部、肩三角部及下腹部等，传统的手术切除曾是治疗病理性瘢痕的主要方法，但是有文献报道，单一手术直接切除病灶虽然短期内的疗效良好，但复发率高达45%～100%，因此，现在已经很少采用单一手术切除作为治疗病理性瘢痕的手段[9]。除了外科手术外，近年来，新的治疗手段不断出現，如糖皮质激素注射疗法、放射疗法、激光疗法、加压疗法、硅酮疗法、基因治疗等[10，11]。糖皮质激素是治疗病理性瘢痕的常见药物，无论单独使用抑或是术后瘢痕内注射，都有确切疗效；放射疗法主要作用是放射线能够显著抑制成纤维细胞分裂、增殖及胶原纤维的合成，与糖皮质激素类似，其既可单一使用，也可在瘢痕手术后辅助治疗；激光治疗目前也体现出巨大的治疗潜力，但是其主要的局限性在于穿透性尚不足，瘢痕的深在部位不能很好的治疗；加压治疗是较为简单易行的方法，主要适应证是瘢痕面积大和不适宜进行其他方法治疗的患者；硅凝胶膜是最近几年发展起来的方法，它对人体皮肤无毒性，无刺激性，不会引起过敏反应，具有强大的应用前景；转基因治疗尚处于研究阶段，效果有待进一步研究[12]。临床上发现，单一的治疗方法效果往往有其局限性，因此，目前对病理性瘢痕的治疗主张多种方法合用。

病理性瘢痕的病理生理过程主要是因成纤维细胞增殖过度，同时胶原纤维也出现大量沉积导致皮肤真皮层出现纤维化，而成纤维细胞的生长失控又是病理性瘢痕形成过程中最重要的因素[13，14]。纤维化疾病的分子机制近年来也取得了较大进展，目前已确定转化生长因子β（TGF-β）、白细胞介素、早期生长应答蛋白1（EGR-1）、血管内皮生长因子（VEGF）等的调控与纤维化疾病的发生有关[15]。而其中的TGF-β/Smad信号通路被认为在纤维化中起重要的作用，在体外实验中，Smad3-siRNA可特异性抑制成纤维细胞中Smad3基因表达，同时有效抑制了胶原纤维的合成[16，17]。Smad家族是在真核细胞中高度保守的分子，从线虫、果蝇到哺乳动物均广泛存在，研究表明Smad信号通路的过度活化诱导了成纤维细胞的过度增殖[18]。目前证实细胞内至少存在Smad 1～Smad 9这9种分子，而TGF-β作为配体形成的复合物在与胞膜受体特异性结合后，由Smad 蛋白家族介导，对细胞核内特异的基因进行调控，TGF-β1是TGF-β家族中的一种，具有强效趋化成纤维细胞的作用[19，20]。

本次研究结果表明，无论是Smad基因还是其表达情况，瘢痕疙瘩组的Smad3、TGF-β1均高于正常皮肤组，增生性瘢痕组的Smad3、TGF-β1同样高于正常皮肤组，差异有统计学意义（P<0.05），与庞久玲等[1]在Smad3和转化生长因子β1在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中的表达：48∶40∶40例标本病理检测研究中的部分结果一致，提示Smad3与TGF-β1介导了病理性瘢痕的发病过程，考虑与TGF-β/Smad 信号通路有关。有研究表明，TGF-β 能够刺激瘢痕疙瘩成纤维细胞（KF）中多数胶原基因mRNA 及其蛋白产物的增加，故实验结果也与体外实验相切合[21]。瘢痕疙瘩和增生性瘢痕虽然临床表现不同，但是作为病理性瘢痕的亚型，发病过程都与TGF-β/Smad信号通路相关，但本次研究的结果并不能说明瘢痕疙瘩和增生性瘢痕出现不同的临床表现的原因，对此，有必要进一步设计实验进行探索。

虽然病理性瘢痕的发病机制目前有多种学说和理论，但是其中可以确定的是 TGF-β/Smad 信号通路在病理性瘢痕中发挥重要作用[22]。总之，TGF-β1和Smad的表达是增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的重要特征，如果能够阻断该信号通路的信息传递，或能够抑制病理性瘢痕的发生、发展。

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