穿心莲内酯对HL—60细胞凋亡、CytC蛋白表达的影响

石静 梁勇刚

【摘要】目的：研究穿心莲内酯诱导人HL-60细胞凋亡及相关机制。 方法：以人早幼粒白血病细胞株HL-60为模型，作用于HL-60细胞的穿心莲内酯设3125、625、125μg/ml三个受试浓度，实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3125μg/ml、625μg/ml、125μg/ml四个组。采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测细胞凋亡率、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响。结果：穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈剂量依赖性。穿心莲内酯作用HL-60细胞24h，CytC蛋白表达增加，125μg/ml作用浓度与溶媒对照相比有统计学意义（P<005）。结论：穿心莲内酯能诱导HL-60细胞凋亡，其诱导凋亡机制可能与CytC释放的增加、线粒体通路有关。

【关键词】 穿心莲内酯；细胞凋亡； CytC

【中图分类号】R2855【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2015）03-0022-02

1材料和方法

11细胞购置及培养人早幼粒白血病HL-60细胞株购于武汉大学细胞保存中心。用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基放置在常规培养箱中传代培养。

12样品配置及实验分组根据预实验结果，作用于HL-60细胞的穿心莲内酯（购自天津天士力制药股份有限公司）设3125、625、125μg/ml 3个受试浓度。用DMSO溶解穿心莲内酯为50mg/ml贮存液，所需浓度在实验前用RPMI1640培养基稀释生成。实验分为溶媒对照组、穿心莲内酯3125μg/ml、625μg/ml、125μg/ml四个组。

13流式细胞仪检测穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡率把对数生长期的HL-60细胞浓度调整为1×106个/ml，以1ml/孔接种于6孔板内，加入不同浓度的穿心莲内酯，作用24h后离心收集细胞，PBS液洗涤细胞两次，按照Annexin V/PI双染法（试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司）步骤操作，1h内上流式细胞仪进行检测，实验结果用WinMDI version29软件进行分析。

14荧光标记/流式细胞术检测Cytc蛋白的表达细胞的培养、接种、加样品同上。穿心莲内酯作用HL-60 24h后收集细胞，800rpm离心5min后，用250μl PBS液清洗2次后重悬细胞于流式管中，加入20μl荧光标记的Cytc（购自Abzoom公司），上流式细胞仪进行检测。

2统计学处理

采用SPSS 115统计软件进行数据的统计分析，用x±SD表示所有实验数据，P<005为差异具有统计学意义。

3结果

31穿心莲内酯作用HL-60细胞24h凋亡定量检测结果显示，和溶媒对照相比，穿心莲内酯各浓度作用于HL-60 24h后，各组细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率均随着穿心莲内酯浓度的升高逐渐升高，量效关系明显；与溶媒对照相比，中、高浓度早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P<005）。见表1。

32穿心莲内酯作用HL-60细胞24h CytC蛋白表达变化结果表明，与溶媒对照相比，不同浓度的穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达逐渐增加，表明穿心莲内酯作用后CytC从线粒体膜间隙释放到胞浆内的量逐渐增加。

4讨论

恶性肿瘤是威胁人类健康的主要疾病之一，可发生在任何年龄段，发病率高，预后不良。不断发掘疗效好、毒副作用低的抗癌中草药是研究的新方向。

笔者在前期研究中发现，穿心莲内酯可以抑制人SKOV3、A431、HL-60细胞增殖，并可诱导SKOV3、A431细胞凋亡，其诱导凋亡可能与线粒体膜电位（MMP）下降有关[1-2]。本研究拟在前期研究的基础上，采用Annexin V/PI双染法流式细胞术检测穿心莲内酯是否能诱导HL-60细胞凋亡、流式细胞术结合荧光染色检测穿心莲内酯对HL-60细胞细胞色素C（CytC）蛋白表达的影响。

Annexin/PI双染法FCM检测结果发现，穿心莲内酯能促进HL-60细胞凋亡，且呈现良好的剂量依赖性； 625、125μg/ml与溶媒对照组相比，早期凋亡率、晚期凋亡率及坏死率差异有统计学意义（P<005）。

细胞凋亡的信号转导机制十分复杂，其中最常见的就是线粒体通路。由该通路启动的细胞凋亡过程受许多蛋白质的调控，以CytC最常见。

CytC是位于正常细胞的线粒体内、外膜之间。在细胞凋亡信号刺激下，CytC可从细胞的线粒体释放进入细胞的胞浆，这是线粒体凋亡通路的关键步骤。在各种刺激因素作用下，线粒体外膜通透性增加、线粒体通透性转变孔（MPTP）持续性开放、MPP逐渐降低，线粒体通透性转变孔开放后，线粒体基质会肿胀，线粒体外膜更易破裂，释放出细胞色素C等膜间蛋白，最终引起细胞凋亡[3]。实验中我们发现，穿心莲内酯作用HL-60细胞24h后，CytC蛋白表达增加，且高浓度（125μg/ml）与溶媒对照组相比有统计学意义（P<005）。这一现象表明：穿心莲内酯作用下，可能使HL-60细胞线粒体膜通透性增高，从而使膜间隙蛋白CytC释放增加[4]。

总之，本研究结果表明，穿心莲内酯能诱导HL-60细胞的凋亡。我们对其机制进行进一步研究中发现，在此过程中CytC蛋白释放增加，进而提示穿心莲内酯可能通过线粒体凋亡途径促进HL-60细胞凋亡。

参考文献

[1]石静，梁勇刚，白慧健，等.穿心莲内酯对SKOV3细胞凋亡及HER2蛋白表达的影响[J].解剖学杂志，2012，35（1）：20-22.

[2]石静，梁勇刚.穿心莲内酯对人皮肤基底细胞癌A431细胞生长、凋亡及增殖细胞核抗原蛋白表达的影响[J].解剖学报，2013，44（1）：73-78.

[3]石静，卿晨.线粒体膜电位改变与细胞凋亡[J].中国民族民间医药，2011，20（7）：20-21.

[4]蒋时红，吴耀松，刘燕，等.胃康舒宁促胃癌细胞凋亡机制与线粒体凋亡途径[J].中国实验方剂学杂志，2013，21：203-206.

（收稿日期：20141217）