枯草芽孢杆菌B504菌株16SrDNA序列测定

李晓舟

[摘 要] 目前，分子生物学分类方法已应用于各种生物的鉴定。rDNA作为研究细菌系统发育关系的理想材料已被细菌学家广泛采用。其中，16SrDNA，约1.5kb，在生物进化过程中较难变异，含有丰富遗传信息，且其序列变化速度与进化距离相适应，因此，是相对较合适的系统发育指标，是现代微生物学分子鉴定的重要手段之一。本研究将结合传统和现代分子生物学分类方法对菌株B504进行鉴定。

[关键词] 枯草芽孢杆菌 16S rDNA序列

[中图分类号] S1 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2015）11-0064-02

1 材料与方法

1.1 材料

枯草芽孢杆菌B504菌株为本试验室保存；细菌基因组DNA小提试剂盒为凯基公司产品；PCR反应所用试剂为TaKaRa（大连）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 B504基因组DNA的提取

采用凯基细菌基因组DNA小提试剂盒提取B504基因组DNA，详细过程按说明书[25]进行。

1.2.2引物设计与合成

根据原核生物16S rDNA的保守序列，并参考文献设计通用引物，由TaKaRa（大连）公司合成，引物序列如下：

上游序列：5-AGACGCTGGCGGCGTGC-3

下游序列：5-ATCATCTGTCCCACCTTCGGC-3

1.2.3 PCR 反应体系和反应条件

1.2.4 PCR扩增反应产物的检测

取8μl PCR产物与2μl上样缓冲液混合，用1.0%琼脂糖凝胶在100V电压下电泳，DNAgreen染色。凝胶于UVP紫外成像系统上观察并拍照【26-28】。

1.2.5 测序

PCR产物送交TaKaRa（大连）公司测序，测序引物同PCR反应引物。

1.2.6 16S rDNA序列分析

运用BLAST 软件对测序结果进行序列分析，与GenBank中已知的16S rDNA序列进行同源性比较对照，以确定其亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 细菌基因组DNA的提取

采用紫外分光光度计检测260/280值为1.834，在1.7～2.0之间，DNA 浓度约为1.3μg·mL-1，电泳检测基因组DNA无弥散现象（图3-3），浓度和完整性均符合PCR扩增的要求【33】。

2.2 16Sr DNA PCR扩增

16Sr DNA PCR扩增产物片段长约1400bp结果[34]，见图3-4。菌株B504的16SrDNA PCR扩增产物电泳结果如图3-4所示。电泳结果表明，以B504菌株提取的总DNA为模板，利用引物，能够扩增出特异性片段，片段大小在1450bp左右。

2.3 16SrDNA PCR扩增产物测序

2.4 B504菌株的测序结果

菌株B504 DNA 经PCR扩增后得到PCR产物，经测序片段长度为1429bp，已提交GenBank，并获登录号No.FJ437209。

2.4.1 Blast比对结果：与GenBank中已知的16S rDNA序列进行比对（Blast），搜索到同源性达到100%的序列有：No.FJ392726（Bacillus subtilis）、No.EU981825（B. amyloliquefaciens）及No.AB244463（B. velezensis）、No.FJ713021（Bacillus licheniformis），结果见图3-5。

3 结论与讨论

结合电镜观察和生理生化特征，将B504初步鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。将测得的B504菌株16S rDNA序列与GenBank中的相关序列进行比对（Blast），结果发现与B. amyloliquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）、B. velezensis（无中文名称）、B. licheniformis（地衣芽孢杆菌）同源性达到100%。

本研究通过细菌16S rDNA序列测定，并运用Blast软件进行比较对照，发现菌株B504与B. subtilis、B. amyloliquefaciens、B. velezensis、Bacillus licheniformis的同源性达100%。解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）与枯草芽孢杆菌（B. subtilis）仅通过形态学特征、培养性状难以区分；但在生理生化反应中，解淀粉芽孢杆菌可利用乳糖进行发酵，枯草芽孢杆菌则不可利用乳糖进行发酵。目前，已有多种基因，如gyrA 、cheA 、α-amylase 、yyaR 、yyaO、tetL 、tetB 等应用于枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的分类和鉴定。Bacillus licheniformis（地衣芽孢杆菌）可厌氧生长，可利用丙酸盐，而枯草芽孢杆菌不能厌氧生长，不能利用丙酸盐，两者通过生理生化测定易于区分。

枯草芽孢杆菌分为B. subtilis subsp. subtilis 和B . subtilis subsp. spizizenii 两个亚种。大量的试验只是为确定其为枯草芽孢杆菌，对其属于亚种分类未作区分。