大鼠体内川芎多成分序贯代谢研究

吕贝然等

摘要：目的 研究川芎单味药中多成分体内动态变化过程，阐明其体内代谢轮廓。方法 采用高效液相色谱法建立川芎水提液指纹图谱，以此同时检测多成分变化情况。体内代谢采用封闭肠环法研究川芎口服后多成分经胃-肠-肝代谢变化过程。结果 川芎水提液指纹图谱中监测到17种成分，在胃肠道稳定性研究中均基本稳定，其中有4种成分被肠道菌代谢，3种成分被肝代谢，2种新成分是肠代谢产物，1种新成分是肝代谢产物。结论 采用序贯代谢，运用封闭肠环法研究中药口服后各成分代谢轮廓是可行的，为中药的代谢研究提供了实验依据。

关键词：川芎；多成分；序贯代谢；封闭肠环；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.04.022

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0077-06

Study on Multicomponent Sequential Metabolism in Rats with Chuanxiong Rhizoma LV Bei-ran， YANG Wen-ning， TANG Ming-min， WEI Li， MA Xiao-yun， LUO Zhi-qiang， LIU Yang （Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

Abstract：Objective To study the multicomponent in vivo dynamic process in Chuanxiong Rhizoma；To elaborate in vivo metabolic profiling. Methods HPLC was used to establish the fingerprint of aqueous extract of Chuanxiong Rhizoma， and multicomponent changes were detected at the same time. Closed-loop intestine method was used to study the multicomponent changes of oral administration of Chuanxiong Rhizoma after stomach-intestine-liver process. Results Totally 17 components were detected in the fingerprint of aqueous extract of Chuanxiong Rhizoma and they were basically stable in the digestive juice. For in vivo metabolism， 4 components were metabolized by intestinal flora；3 components were metabolized by liver；2 new components were the metabolites of intestinal flora；1 component was the metabolite of liver. Conclusion Multicomponent sequential metabolism and closed-loop intestine method were used to clarify that multicomponent metabolic profiling was feasible， and it could provide experimental basis for the metabolism of traditional Chinese medicine.

Key words：Chuanxiong Rhizoma；multicomponent；sequential metabolism；closed-loop intestine method；rats

川芎為伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎，具有活血行气、祛风止痛功效，临床上广泛用于治疗心血管疾病。目前研究川芎单体成分代谢的较多，如以藁苯内酯为主的川芎挥发油的代谢[1-3]、药典指标成分阿魏酸的药代和体内代谢[4-6]和以川芎嗪为代表的生物碱的代谢[7-8]。而关于川芎单味药多成分同时代谢的研究较少[9-10]。此外有研究表明，在临床应用中不应简单地用纯品单体

基金项目：国家自然科学基金（81274042）

通讯作者：刘洋，E-mail：liuyang@bucm.edu.cn

的药动学及代谢参数来推测服用单味中药后其有效成分的体内过程，如藁苯内酯以单体及川芎提取物形式口服后，以川芎提取物服用的藁苯内酯的消除率明显高于以单体形式服用[11]。另有报道，大鼠灌胃阿魏酸对照品、川芎药材提取物、复方脑得生片后阿魏酸的Cmax值为阿魏酸对照品组>复方脑得生片>川芎药材提取物[12]。因此，将川芎中的多成分作为一个彼此相互联系的整体，研究其在体内代谢的相互影响是非常有必要的。本研究采用对照比较法依次进行消化液及消化酶代谢、肠道菌群代谢、肠壁代谢、肝代谢研究。因4个过程在空间和时间上保持连续性，因此将其命名为“序贯代谢”。通过指纹图谱跟踪记录川芎口服后多成分序贯代谢过程动态变化，运用动物实验研究川芎药材多成分整体代谢，定性阐明有效成分代谢过程，为川芎的临床用药提供合理的实验依据。

1 仪器、试药与动物

Waters液相色谱系统（600四元泵，美国Waters公司），2487双波长紫外检测器，Empower 2工作站；电子分析天平（BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司）；pH酸度计（FE20，梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司）；1-15PK离心机（德国Sigma公司）。

川芎饮片（北京同仁堂药店）经北京中医药大学张贵君教授鉴定为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；三氟乙酸（synthesis grade）购于Scharlau Chemie S.A.公司（西班牙巴塞罗那）；1-氨基苯并三唑（北京百灵威有限公司）；娃哈哈纯净水购于娃哈哈集团公司（中国杭州）；其余试剂均为分析纯。

SPF级健康雄性SD大鼠，6周龄，体质量（300±40）g，北京斯贝福实验动物科技有限公司提供，动物合格证号SCXK（京）2014-0004。饲养于符合国家标准的屏障环境中，室温22～24 ℃，相对湿度60%。实验前适应性喂养1周以上，自由饮水和进食。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 Krebs-Ringer's营养液配制 称取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl2 0.37 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、葡萄糖1.40 g，加蒸馏水定容至1000 mL，调节pH为7.39～7.41，放置备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取饮片100 g，精密称定，置具有冷凝回流装置的圆底烧瓶中，加1000 mL去离子水，浸泡1 h后回流提取1.5 h，趁热过滤出提取液。再向烧瓶中加入1000 mL去离子水，回流提取1 h，趁热过滤出提取液。合并提取液。滤液经过水浴浓缩，并用K-R营养液定容至100 mL，制成含原药材1 g/mL的溶液。

2.1.3 人工胃液的配制 取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL，与胃蛋白酶10 g，摇匀后，加水稀释至1000 mL，即得[13]。

2.1.4 人工肠液的配制 取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将两液混合后，加水稀釋至1000 mL，即得。

2.2 色谱条件

色谱柱为Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱温30 ℃，检测波长280、300 nm，流速1 mL/min，流动相为0.1%三氟乙酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0 min，98%A；30 min，66%A；35 min，35%A；50 min， 0%A）。

2.3 序贯代谢

2.3.1 胃肠道稳定性研究 消化液预温孵5 min后，分别在50 mL胃液和50 mL肠液中加入1 mL供试品溶液，在37 ℃振摇情况下分别温孵。人工胃液中温孵6 h，每隔1 h取样7 mL，立即用0.1 mol/L NaoH调pH为6～7从而终止反应，并用去离子水定容至10 mL。人工肠液温孵8 h，每隔1 h取样7 mL，并用去离子水定容至10 mL。温孵液过0.45 μm滤膜，进行液相测定，对比分析温孵后药液的指纹图谱。

2.3.2 肠道菌代谢研究 5只SD大鼠禁食12 h，自由饮水，分为2组，4只为供血组，1只为实验组。

腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，供血组腹主动脉取血，血液放于肝素化离心管，置于37 ℃水浴锅中保温。实验组大鼠颈静脉插管输血，保证实验过程的血液损失得到补充，肠系膜静脉插管收集血液。沿腹中线打开腹腔约3～4 cm选取结肠，在肠段首末端系上丝线，用注射器将药液注入肠腔。当药液到达肠段末端，用丝线结扎，然后取下注射器并结扎肠段前段。通过蠕动泵从颈静脉给实验鼠供血。在蠕动泵另一端开始收集血液，同时结扎门静脉，待实验完成后，收集肠道内药液。

无肠道菌实验手术方法与有肠道菌实验相同，仅在药液注入小肠前，于小肠末端切一横向口，用温热的生理盐水洗净肠内容物后再进行后续操作。实验持续1.5 h，收集的血液放入肝素化离心管中，4000 r/min离心10 min，取上清液，加入3倍量甲醇，涡旋2 min， 10 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜，进行液相分析。

2.3.3 肠壁酶代谢研究 采用无肠菌实验的手术方法。在多成分药液注入肠道循环前，将非特异性CYP450酶抑制剂氨基苯并三唑加入冲洗液和药液中。1 h后肠系膜静脉收集18 mL血样，处理方法同肠道菌实验。

2.3.4 肝代谢研究 肝代谢后多成分进入血液系统，采用封闭肠环法，将川芎药液封闭在结肠，不需要供血，不结扎门静脉，1 h后腹主动脉采血约10 mL，样品处理同肠道菌实验。

3 结果

3.1 胃肠道稳定性

胃肠道的酸碱物理环境及消化酶均有可能改变化学成分的结构，因此口服药物经过消化道多成分的变化情况值得研究，这也是序贯代谢的第一步。前期研究已显示川芎在消化道溶出情况良好[14]，本实验通过川芎药液指纹图谱对比分析温孵前后多成分的变化。成分变化用相对于温孵0 h的峰面积变化率f表示。并规定f>10%则认为此成分不稳定。图1为川芎药液的指纹图谱，图中共标出17种药材中的成分（C1～C17），此17种成分的胃肠道稳定性结果见表1。从数据可知，成分6在人工胃液及人工肠液中fmax>10%，成分7、12、13在人工肠液中fmax>10%，但这些均是经人工胃液6 h及人工肠液8 h孵育后其变化率大，而一般药物在胃滞留时间不超过2 h，肠滞留时间不超过4 h。因此认为川芎药液中多成分在胃肠道中比较稳定。川芎药液在人工胃液和人工肠液中温孵不同时间的HPLC图谱见图2、图3。

3.2 肠道菌代谢

肝脏和小肠是外源性物质代谢的主要器官[15]。肠内细菌对中药成分的生物转化以水解为主，氧化和还原反应为辅，所涉及的代谢酶主要有水解酶、氧化还原酶、裂解酶和转移酶[16]。通过比较有菌和无菌条件下血浆样品中多成分HPLC图谱得出肠道菌代谢情况。为了更清楚说明代谢，以成分16作为内参（此峰峰面积最大且在人工胃液和人工肠液中相对偏差为3.27%和2.89%，比较稳定），用各种成分相对峰面积来说明各成分代谢情况。由表2和图4中A与B比较可知，成分1在有肠菌和无肠菌的血浆中均未检测到，说明其可能被酶代谢或者吸收较弱。成分6、7、13和15在有肠道菌的血浆样品中均未检测到，说明其可能被肠道菌代谢掉。成分3在肠道菌的血浆样品中相对峰面积增加很大，说明其吸收较成分16强或者是其他成分代谢产物。同时有7种新成分产生。新成分1、2只在有菌群的血浆样品中检测到，表明其是肠道菌的代谢产物。新成分3、4、5、6、7在2种血浆样品中均能检测到，说明这些成分不是肠道菌代谢产物，可能是酶代谢产物。

3.3 肠壁酶代谢

肠在药物的全身代谢中占有重要的地位，肠壁酶的首过代谢通过一些化学药品被证实，但多成分代谢研究的文献相对较少。其结果通过比较有无酶抑制剂情况下的多成分指纹图谱得到。从表2和图4中B与C比较可知，成分1仍未检测到，说明其被代谢或者未吸收，结果仍不确定。成分4相对峰面积增加很多，说明其可能是由其他成分转化而来，也可能是CYP450酶抑制剂的底物。在这2种血浆样品中，成分11相对峰面积增加很大，说明可能是非CYP450酶的代谢物。

3.4 肝代谢

大多数药物在进入全身血液前都会经历肝代谢，丰富的Ⅰ相反应和Ⅱ相反应酶是药物代谢的主要原因。肝代谢结果通过比较腹主动脉血和有菌血样中多成分的HPLC指纹图谱得到。从表2和图4中A与D比较可知，成分1在2种血浆样品中未检测到，所以仍不能确定其是否代谢或者吸收。成分6、7、13和15在有肠菌和肝代谢血中均未检测到，说明最可能是被肠道菌代谢。成分2、3、8只在动脉血中消失，说明其被肝脏代谢。新成分8只在动脉血中检测到，说明其是肝代谢产物。新成分3、4、5、6、7相对峰面积在腹主动脉血中明显增大，说明它们是肝代谢产物。

3.5 各成分可能代谢位点

通过综合分析4个连续实验结果，将每种成分可能代谢位点一一列出，结果见表3。

4 讨论

本研究结果显示，川芎主要成分多为原型吸收进入体液循环，锁定的17种原型成分中9种成分原型吸收入血，1种成分未吸收或被酶代谢，4种成分被肠道菌代谢，3种成分被肝代谢，2种新成分是肠代谢产物，1个新成分是肝代谢产物。定性阐述川芎多成分在大鼠体内的动态过程，初步表明序贯代谢的可行性。

某些成分在胃肠道稳定性研究中不太稳定，但其变化均在4、6、8 h时变化率比较大，一般药物在胃滞留时间不超过2 h，肠滞留时间不超过4 h[17]。因此可以认为川芎药液中多成分在胃肠道中比较稳定。

川芎中单一成分的体内代谢研究已很清楚，其整体用药的多成分药代动力学研究不多，而川芎单味药中多成分体内动态代谢情况尚未见报道。本研究采用序贯代谢，运用封闭肠环法探讨了多成分体内动态代谢情况，更加形象地反映其在体内的吸收代谢轮廓，同时从中药多成分环境角度出发更符合中药用药特点，为中药代谢研究提供一种可参考的方法。为进一步阐明川芎药效物质基础，笔者下一步会进行液相色谱-质谱分析，对代谢和入血成分进行结构解析。

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（收稿日期：2014-12-10；编辑：陈静）