久泻灵颗粒对脾肾阳虚型溃疡性结肠炎大鼠相关细胞因子的影响

许雅清第

摘要：目的 探讨久泻灵颗粒治疗脾肾阳虚型溃疡性结肠炎的作用机制。方法 采用灌服大黄水煎液+肌肉注射氢化可的松并结合2，4，6-三硝基苯磺酸+乙醇灌肠建立动物模型。将90只大鼠随机分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组和久泻灵颗粒7、14、21 d组，各治疗组给予相应药物干预。采用酶联免疫法检测各组大鼠血清及结肠组织中白细胞介素（IL）-1、IL-6、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及干扰素-γ（IFN-γ）含量。结果 与空白组比较，模型组大鼠血清及结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量均升高（P<0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠血清及结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量均降低（P<0.05），其中久泻灵颗粒21 d组作用最明显（P<0.05）。结论 久泻灵颗粒通过调节脾肾阳虚溃疡性结肠炎模型大鼠IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的分泌达到抑制炎症发生，从而保护结肠黏膜。

关键词：久泻灵颗粒；溃疡性结肠炎；脾肾阳虚；白细胞介素-1；白细胞介素-6；肿瘤坏死因子-α；干扰素-γ；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）04-0059-04

Effects of Jiuxieling Granules on IL-1， IL-6， TNF-α， and IFN- γ in Rats with Spleen Kidney Yang Deficiency Ulcerative Colitis XU Ya-qing1， LI Hai-long1，2， QIU Jia-quan1， JIA Yu-xin1， CHENG Xiao-li1， MING Hai-xia1， LIANG Yong-lin1， WU Yu-hong1 （1.Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China；2.New Products of Gansu Province Chinese Medicine Engineering Laboratory， Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To detect mechanism of action mode of Jiuxieling Granules in spleen and kidney yang deficiency ulcerative colitis. Methods The perfusion of Rhei Radix et Rhizoma Decoction plus intramuscular injection of hydrocortisone and combined with TNBS and ethanol enema were employed to establish UC animal model. Ninety rats were randomly divided into blank group， model group， SASP group and Jiuxieling Granules 7 days， 14 days and 21 days groups. All treatment groups received relevant medicine intervention. The levels of IL-1， IL-6， TNF-α， and IFN-γ in serum and colon tissue were detected by ELISA. Results Compared with the blank group， the levels of IL-1， IL-6， TNF-α， and IFN-γ in serum and colon tissues of rats in model group increased （P<0.05）；compared with the model group， the levels of IL-1， IL-6， TNF-α， and IFN-γ in serum and colon tissues of rats in treatment groups were reduced greatly （P<0.05）， among which Jiuxieling Granules 21 days group showed the most obvious effects （P<0.05）. Conclusion Jiuxieling Granules can regulate the normal secretion of the levels of IL-1， IL-6， TNF-α， and IFN-γ in serum and colon tissue of model rats， and inhibit inflammation and protect colonic mucosa.

Key words：Jiuxieling Granules；ulcerative colitis；spleen and kidney yang deficiency；IL-1；IL-6；TNF-α；IFN-γ；rats

潰疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）又称非

基金项目：国家自然科学基金（81260520）

通讯作者：吴玉泓，E-mail：yhw67@126.com

特异性溃疡性结肠炎，具有治愈难度大、复发率高的特点，临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便及里急后重为主要表现，被认为是结肠癌癌前病变[1]。现代医学针对UC多采用柳氮磺吡啶结合皮质激素进行治疗，但疗效并不理想。吴氏等[2]通过系统评价各数据库文献对UC中医证候进行整理，结果发现，脾肾阳虚型UC发生率位居UC各类证候之首。研究表明，此类患者宜用温补脾肾类药物以取脾肾双补、标本同治之功，临床治疗效果良好[3]。本研究采用脾肾阳虚型UC模型大鼠，观察久泻灵颗粒对模型大鼠白细胞介素-1 （IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及干扰素-γ（IFN-γ）含量的影响，探讨其治疗脾肾阳虚型UC的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠90只，体质量（180±10）g，雌雄各半，雄鼠鼠龄为40日龄左右，雌鼠鼠龄为45日龄左右，甘肃中医学院实验中心提供，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001。

1.2 药物

三硝基苯磺酸（TNBS，购自Sigma公司，批号111M5001V）；柳氮磺砒啶（购自上海信谊天平药业有限公司，批号120915）；氢化可的松注射液（天津生物化学制药有限公司，批号13060211）。大黄水煎液（药材购自甘肃中医学院附属医院中药房，常规水煎后，按13.5 g原药材/kg浓缩到浓度为1.35 g/mL）。久泻灵颗粒按处方比例进行配伍（人参∶炒白术∶干姜∶炙甘草∶吴茱萸∶补骨脂∶肉豆蔻∶五味子=3∶3∶3∶3∶1∶4∶2∶2），甘肃中医学院附属医院制剂室加工。采用多功能提取罐，加水提取2次，加水量分别为药材的8、6倍，时间为每次2 h；煎液过滤，滤液混合，浓缩至稠膏，按膏∶糊精∶糖粉=1∶0.5∶2配制，将配制的药材进行制粒，烘干，整粒，检验，分装即得。常温干燥保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

IL-1、IL-6、TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒（批号20140301A），南京建成生物工程研究所。Benchmark Plus连续波长酶标仪（美国Bio-rad），高速冷冻离心机（Biofuge-Stratos），匀浆器。

2 实验方法

2.1 分组与造模

适应性饲养1周后，采用随机数字表法将大鼠分为空白组、模型组、柳氮磺吡啶组和久泻灵颗粒7、14、21 d组，每组15只。脾肾阳虚型模型参考文献[4-5]造模。第1阶段复制脾虚模型：上午灌服大黄水煎液，2 mL/（只·d），下午灌服蒸馏水2 mL/（只·d），连续14 d；第2阶段在脾虚基础上继续复制脾肾阳虚模型：第15日在大鼠左右肢臀部交替肌肉注射氫化可的松25 mg/（kg·d），并灌服蒸馏水2 mL/（只·d），连续10 d。第25日禁食不禁水，第26日用100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠，复合法建立脾肾阳虚型UC大鼠模型。

2.2 给药

成模后，空白组和模型组予生理盐水灌胃，久泻灵颗粒组与柳氮磺砒啶组分别给予久泻灵颗粒和柳氮磺砒啶0.2 g/kg药物灌胃，2 mL/只。等效剂量以成人常规剂量按人与动物体型系数折算[6]，灌胃体积为1 mL/100 g体质量，每日1次，连续3周。

2.3 标本采集及处理

空白组、模型组、柳氮磺砒啶组大鼠分别于造模21 d末，久泻灵颗粒组大鼠分别于造模7、14、21 d末采集血清/结肠组织，水合氯醛麻醉采血后断颈处死制备标本。血清制备：股动脉取血，3000 r/min离心10 min，取血清置4 ℃冰箱保存，待测。结肠组织匀浆制备：截取结肠病变处，冲洗、称重后剪碎，加9倍生理盐水匀浆，12 000 r/min离心10 min，将上清分装置4 ℃冰箱保存，待测。ELISA检测血清及结肠组织IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ含量，具体操作参照试剂盒说明书。

3 统计学方法

采用SPSS16.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，根据方差齐性检验结果，多组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 各组大鼠一般生存状况

空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及饮食量正常，皮毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。模型组多数在第5日后开始出现蜷卧、眯眼等部分症状，第10日后症状开始明显，大鼠蜷卧扎堆，食量减少，体质量开始减轻，便形质软，部分动物眯眼弓背。往后动物症状逐渐加重，体质量明显减轻，便形稀溏，肛周污秽，少食怠动，畏寒，成群蜷缩或弓背，毛发失去光泽而枯槁疏散。治疗组第6日出现轻度蜷卧、眯眼，第13日后出现少食怠动、体质量下降、便形质软等，治疗至16 d后上述症状开始减轻或消失，表现为反应较为灵敏，活动及饮食量增加，粪便部分呈颗粒状，眯眼弓背消失。造模过程中，模型组死亡2只，久泻灵颗粒7、14 d组各死亡1只，柳氮磺吡啶组死亡2只，故检测时每组统一选取10只。

4.2 久泻灵颗粒对大鼠血清和结肠组织中白细胞介素-6和白细胞介素-1含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清和结肠组织中IL-1、IL-6含量明显升高（P<0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠血清及结肠组织中IL-1、IL-6含量明显降低（P<0.05），其中久泻灵颗粒21 d组作用显著（P<0.05）。

4.3 久泻灵颗粒对大鼠血清和结肠组织中肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠血清和结肠组织中TNF-α、IFN-γ含量升高（P<0.05）；与模型组比较，各治疗组大鼠血清及结肠组织中TNF-α、IFN-γ含量降低（P<0.05），其中久泻灵颗粒21 d组作用最显著（P<0.05）。结果见表3、表4。

5 讨论

近年来研究表明，在UC的诸多发病机制中免疫因素至关重要，其中免疫调节异常导致的组织损伤受到广泛关注。IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ等促炎症细胞因子是公认的介导UC发病的细胞因子。IL-1及IL-6是一种能激活多种免疫和炎症细胞的炎性细胞因子，其中IL-1β能促进血管内皮-白细胞黏附分子的表达，趋化中性粒细胞等炎性细胞进入肠道病变部位，从而引起肠道炎症反应和组织破坏[7]。TNF-α是一种17 000 Mr的非糖蛋白，主要由单核细胞、巨噬细胞和T细胞产生，不仅能刺激巨噬细胞、纤维母细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和内皮细胞分泌花生四烯酸代谢物、肌酸激酶和蛋白酶，还能吞噬细胞产物和补体片段引起细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿的发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。IFN-γ是一种二聚体糖蛋白，由Th1淋巴细胞和自然杀伤细胞产生，它的免疫调节活性强，是强有力的吞噬细胞和中性粒细胞激活物[8]，在炎症反应中也参与的调节。

在UC发病机制中，可能是促炎因子表达增多、作用增强，从而产生一个异常的免疫应答反应，最终导致UC的发病，如TLR4介导脂多糖的信号传导通路产生许多促炎因子IL-1、IFN-γ、IL-6、TNF-α等，同时这些促炎因子又会促使肠上皮细胞的TLR4及其辅助蛋白的表达增加，而且导致对脂多糖的敏感性增强，从而触发和加重UC的发病[9]。

久泻灵颗粒主治脾肾阳虚型UC，方用理中丸加四神丸而成，具有调理阴阳、燮理虚实、补肾温肠、利湿止泻的功能，全方体现攻涩兼施、辛开苦降、寒热并投、升降协调四大特点。方中人参、炒白术、补骨脂温补脾肾补虚治本，肉豆蔻祛湿利浊攻邪，还能行气与人参、白术共奏行补之功，干姜、吴茱萸温中散寒，五味子涩肠止泻以治标，并收敛耗散之正气。

本研究结果表明，久泻灵颗粒能降低脾肾阳虚型UC模型大鼠血清和结肠组织中IL-1、IL-6、TNF-α及IFN-γ的表达，从而抑制炎症及损伤的进一步发生，对结肠黏膜有明显的保护作用。

参考文献：

[1] 邵文琳，谢斌.结肠炎相关性结肠癌前病变的研究进展[J].江西中医学院学报，2010，22（5）：87-91.

[2] 岳宏，王天芳，陈剑明，等.溃疡性结肠炎常见中医证候及证候要素的现代文献研究[J].北京中医药大学学报，2010，33（5）：306-308.

[3] 张立君，白光.溃疡性结肠炎中医药治疗概况[J].辽宁中医药大学学报，2011，13（9）：212-214.

[4] 陈贤坤，王立峰，赵慧，等.强肌健力方对脾肾两虚大鼠细胞因子水平