高效液相色谱法同时检测虫草制品中腺苷和虫草素含量的研究

黄丽俊　李利东　宓晓黎

摘要：对已有方法和规范中样品前处理方法和色谱条件进行了优化和对比研究，建立检测虫草制品中腺苷和虫草素含量的反相高效液相色谱方法。样品经水超声提取40min，离心过滤后进行分析。采用C₁₈色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），以水-甲醇（85：15，V/V）为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为260nm。本方法检测限为0.2μg/mL，定量限为1.0μg/mL。以所建立的方法对虫草制品进行分析，样品加标回收率在94%～103%，相对标准偏差均小于3%。该检测方法简便、准确，并能同时测定腺苷和虫草素。

关键词：虫草制品；高效液相色谱；腺苷；虫草素

中图分类号：O657.7+2

文献标志码：A

论文编号：2014-0289

0引言

蛹虫草为子囊菌亚门麦角菌目麦角菌科虫草属的模式种，又名北冬虫夏草，可人工批量培育，与冬虫夏草是同属，2009年被批准为新资源食品。由于虫草具有抑菌、抗病毒、抗肿瘤等多种药理作用而引发人们的关注，并深度开发，目前市场上有以虫草为原料的各类药品、保健食品及食品，其剂型有含片、胶囊、口服液、固体饮料、酒等。中国药典2010版冬虫夏草项下腺苷含量测定采用HPLC法，CFDA用HPLC测定蛹虫草菌粉中虫草素含量，《保健食品检验与评价技术规范》2003版（简称《规范》）中的要求以虫草为主要原料的保健食品中腺苷的测定用HPLC方法，用药典或《规范》中的方法测定虫草类制品中腺苷含量时结果偏低，上述方法均单一检测虫草中腺苷或虫草素。农业部标准NY/T 2116-2012可同时检测虫草中腺苷和虫草素，但提取时间过长。近年来国内采用高效液相色谱法测定蛹虫草中腺苷和虫草素含量的报道较多，腺苷和虫草素等核苷类成分是虫草的主要功效成分，因此对这2种成分的检测尤为重要。本研究目的是尽量简化样品前处理步骤，避免使用有毒有机溶剂，优化HPLC方法，建立同时测定虫草制品中腺苷和虫草素的HPLC方法。

1材料与方法

1.1试验时间、地点

研究室内试验在江苏无锡进行。

1.2仪器与试剂

戴安UltiMate3000高效液相色谱仪，UltiMate3000紫外检测器，Chromeleon色谱工作站；KQ-100B超声波清洗器，腺苷、虫草素对照品（中国药品生物制品检定所），甲醇、乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯，试验用水为二次蒸馏水。

1.3试验方法

1.3.1标准溶液的配制 准确称取腺苷对照品0.0190g，用流动相溶解并定容至25mL容量瓶，称取虫草素对照品0.0160g用流动相溶解并定容至50mL容量瓶，分别配制成含腺苷0.76mg/mL和虫草素0.32mg/mL的标准溶液。

（1）混合标准液：分别取上述标准溶液1mL于10mL容量瓶中，水定容至刻度，配制成含腺苷76μg/mL和虫草素32μg/mL的混合标准液。

（2）标准曲线浓度：将混合标准液梯度稀释分别配制成腺苷浓度为2.375、4.75、9.5、19、38μg/mL，虫草素浓度为1、2、4、8、16μg/mL的系列标准溶液。

1.3.2样品的前处理 将蛹虫草制品混和均匀，精确称取样品1.0g于50mL离心管中，加入25mL提取液后超声提取，提取结束后用提取液定容至刻度，混匀后以10000vpm离心10min，经0.45μm滤膜过滤后供液相色谱分析用。

1.3.3色谱条件 色谱柱为C₁₈柱（250mm×4.6mm，5μm）流动相：水-甲醇（85：15，V/V）；流速1.0mL/min；进样量为20μL；柱温30℃；检测波长260nm。

2结果与分析

2.1样品前处理方法的优化

2.1.1提取溶剂的选择 中国药典中用90%甲醇加热回流提取，《规范》中用60%乙醇提取，农业部标准中用水提取，笔者分别比较了同等处理条件下，水、60%乙醇、90%甲醇、100%乙醇5种溶剂提取效果，结果显示以水提取效果最好，检测结果见表1。

由表1可知，所测样品中腺苷和虫草素含量均随提取液中乙醇体积分数的增加而降低，用水提取的含量最高，这与农业部标准使用的提取溶剂一致。

2.1.2提取时间的选择 同一个样品，用水作为提取剂，分别超声提取10、40、80、180min，结果见表2。

由表2可知，在水做提取溶剂的条件下，提取时间短则提取不完全，超声40min时虫草素含量达到最大，随着超声时间延长提取效果没有增加，所以提取时间定为40min。

2.2液相色谱条件的选择

2.2.1流动相的选择 中国药典和《规范》中选用磷酸盐溶液与甲醇的混合体系作为流动相，而长期使用盐相会减少色谱柱的使用寿命，从而增加检测成本。农业部标准中选用乙腈-水（5：95，V/V）作为流动相，考虑到乙腈的毒性较大，笔者采用不同比例的甲醇-水作为流动相，对腺苷和虫草素的分离效果进行比较，最终确定甲醇-水（15：85，V/V）为流动相，流速1.0mL/min，在此条件下，标准品和样品中腺苷和虫草素能得到很好分离，色谱图见图1，样品图谱中腺苷和虫草素的保留时间与对应的标准品色谱图一致，并且与其相邻色谱峰的分离度大于1.5。

2.2.2检测波长的选择 取腺苷和虫草素对照品溶液在200-400mm进行紫外扫描，发现腺苷和虫草素的最大吸收波长为260nm，因此确定检测波长为260nm。

2.3方法学考察

2.3.1方法标准曲线、检出限、定量限 将标准系列依次进样，进样量均为20μL，以标准品浓度（X）为横坐标，对应的峰面积（Y）为纵坐标，对标准系列进行线性回归，得腺苷标准系列（2.375～38μg/mL）的回归方程为：Y=0.981X+0.2074，r=1；虫草素标准系列（1.00～32.0μg/mL）的回归方程为：Y=0.9795X+0.0806，r=1。腺苷和虫草素在上述浓度范围内线性关系良好。测定色谱峰达到3倍信噪比时，对应的加标浓度为检出限；达到10倍信噪比时，对应的加标浓度为定量限。即本方法检出限为0.2μg/mL，定量限1.0μg/mL。

2.3.2重复性试验 取6份平行样品，按照优化后的条件进样检测，结果样品中腺苷、虫草素的平均质量分数分别为227、74.5mg/100g，RSD分别为1.12%和1.35%（n=6），表明本方法的重复性良好。

2.3.3稳定性试验 样品用水超声提取40min后，分别放置0、4、8、12、24h后进样，测定腺苷、虫草素的峰面积，结果腺苷、虫草素的峰面积的RSD分别为2.12%和1.56%，表明试验提取的溶液，腺苷和虫草素的含量在24h内保持相对稳定。

2.3.4方法准确度及精密度 取已知含量的3种虫草制品，按照1.3.2章节下提到的方法处理，在1.3.3条件下测定，同时进行样品加标回收试验，每个样品每个添加水平取平行样3份，计算方法回收率和精密度，结果见表3。加标回收率在94%～103%，相对标准偏差均小于3%。说明该方法加标回收效果较好，适合于虫草制品含量测定。

3讨论

农业部标准NY/T2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法可以很好地分离虫草素和腺苷，但是需要用水超声提取3h，耗时较长，本试验对不同提取时间进行比较，发现提取40min后随着超声时间延长腺苷虫草素含量没有提高。

《保健食品检验与评价技术规范》2003版和中国药典2010版冬虫夏草项下腺苷含量测定，都采用磷酸盐溶液与甲醇的混合体系作为流动相，作者比较几种流动相分离效果，水-甲醇（85：15，V/V）作为流动相时样品中腺苷和虫草素的色谱峰分离度大于1.5，能够得到很好地效果，同时此流动相避免磷酸盐对色谱柱的损伤。本研究建立的液相色谱方法操作简单，检测结果稳定性好、准确度高，适合于虫草制品中腺苷和虫草素定性定量分析。