口蹄疫灭活疫苗基础研究

李培林等

摘 要：口蹄疫灭活疫苗目前仍然是控制口蹄疫的主要手段。随着悬浮工艺和纯化工艺的改进，使口蹄疫灭活疫苗的质量有很大的提高，但基础研究也不容忽视。本文主要探讨影响种毒制备的一些因素，包括细胞状态、接毒量的改变及毒液保存条件对种毒质量的影响。基本得出如下结论：第一，细胞状态会影响收毒时间的变化，同时一定程度上也会影响LD50毒价的变化；第二，接毒含量增高，收获时间缩短，而低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系，适宜地改变接毒量有助于提高种毒质量；第三，不论是4 ℃冷藏保存，还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价均有不同程度的损失，而且4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式。因此，上述因素在生产中要细化研究，对提高种毒质量起到指导意义。

关键词：BHK-21细胞；口蹄疫灭活疫苗；种毒制备；质量控制

中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1001-0769（2015）09-0028-03

口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）引起偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，严重危害畜牧业的发展[1，2]。OIE将该病列为A类家畜传染病之首，而我国农业部也把该病列为第一类防控疫病。对于口蹄疫的防控，目前仍以灭活疫苗为主。此项措施在我国重大疫情中发挥巨大防治作用。

对于口蹄疫疫苗生产企业，质量的提高、产品创新以及员工素质提高是企业发展的动力。因此，疫苗质量提高离不开工艺革新以及基础方面的优化研究。工艺革新是疫苗制备企业的硬件系统，由企业的综合实力决定。而基础研究主要包括：种细胞的驯化与筛选、种毒的优化制备以及抗原纯化等相关研究[3，4]。从种毒制备人员的自身素质讲，筛选制备出良好的种毒，不仅给疫苗前端解决了问题，而且也给后端工艺带来可喜的成果。因为种毒质量好坏、抗原含量高低，直接影响口蹄疫抗原中的有效成分，而且关系到疫苗的免疫效果。在生产中获得一支理想的种毒支系，不仅给生产人员带来方便，而且也给企业带来很大的经济收益。因此，制苗毒株的选择及质量的提高是疫苗生产的首要问题[5]。

筛选优质的种毒需要有正确的操作方法，更需要掌握影响种毒质量的一些因素。目前，影响贴壁种毒因素主要有细胞贴壁状态、维持液的酸碱度、接毒量、最佳收获时间、检验周期、种毒保存时间以及种毒传代路线及无菌观念等，上述因素均能影响种毒毒价及质量效果。因此，本次试验主要探讨影响种毒质量的一些因素，并进行分析与总结，从而通过过程控制，调整传代条件、保存方法，筛选出毒价稳定、146S高的基础种毒，从而保障种毒质量，提高企业竞争力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与设备

二氧化碳培养箱（Thermo 8000 WJ）；生物安全柜（HFsafe-1200型）；倒置显微镜清（OLMPUS）；4 ℃平温冰箱；-20 ℃卧式冷冻冰柜；温室、生物细胞转瓶机、细胞观察台；超低温冰箱（Thermo ULT1386-3-V41）、移液器、恒温震荡培养箱等仪器。以上设备均由金宇保灵生物药品有限公司提供。

1.1.2 BHK-21细胞

由金宇保灵生物药品有限公司提供，分种传代一般按1∶3～1∶4进行操作，加入营养液，置37 ℃培养箱中培养。营养液配制按本公司的配液SOP进行操作。

1.1.3 O型口蹄疫基础种毒

由金宇保灵生物药品有限公司质量检验部提供FMDV基础种毒，由车间领取并由专人管理。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21细胞贴壁状态对种毒的影响

按常规细胞传代的方法，将细胞复苏传代后，将同批培养24 h、48 h、53 h、72 h、96 h细胞，每瓶细胞换液，加入病毒维持液100 mL，同时每个培养时间组下设两个重复，分别按5 %～8 %的接毒量接毒，接毒完成后置二氧化碳培养箱37 ℃培养6 h～8 h观察，病变达到90 %时收获病毒冷冻保存后混勻测病毒含量。

1.2.2 改变接种比例对筛选种毒的影响

选同批48 h、72 h培养阶段的BHK-21细胞，细胞换液，加病毒维持液100 mL，一组以7 %～8 %的接毒量接毒，另一组以1 %接毒量接毒，置二氧化碳培养箱37 ℃培养6 h～8 h观察，病变达到90 %时收获病毒冷冻保存后混匀测病毒含量，连续传代3次。

1.2.3 不同保存方式对种毒质量的影响

通过测毒结果筛选出毒价高和毒价低的种毒，然后分别将上述两种种毒，进行4 ℃平稳保存和-20 ℃冷冻保存，保存期限为7月，经过测毒结果分析计算不同时间毒价的损失率，毒价损失率=（原样毒价-不同时间段的毒价）/原样毒价，记录结果。

1.2.4 LD50测定

用pH值为7.6～7.8的细胞维持液将待测各批次种毒样品进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9 3个稀释度，每个稀释度颈背部皮下接种2～3日龄乳鼠4只，设对照2只，每只注射0.2 mL，接种后观察7 d，根据发病死亡乳鼠数按Reed-Muench法计算LD50。

2 结果与分析

2.1 BHK-21细胞贴壁状态对种毒因素的影响

细胞培养24 h、48 h、53 h、72 h、96 h后分别按5 %～8 %的接毒量接毒收获毒和LD50情况，具体详见表1与图1。

由表1图1可知，随着BHK-21细胞培养时间的延长，即细胞从24 h到96 h的过程中，细胞表现基本形成单层、致密单层、脱落等现象的发生。因此，选择不同培养时间段的细胞，对筛选种毒支系有一定的影响，从上述数据分析可知，细胞培养时间与收毒时间存在一定的相关性，从LD50毒价分析可知，毒价上升的阶段对应的是细胞48 h～72 h培养阶段。

2.2 改变接种比例对筛选种毒的影响

7 %～8 %正常剂量组与1 %低剂量组种毒传代收毒情况具体情况详见表2与表3。

从表2可知，按7 %～8 %种毒含量，连续传3代，种毒LD50基本在7.5～8.0范围内变化，说明按7 %～8 %正常含量接毒，可以得到理想的种毒支系。而且可以保证抗原的正常生产。从收毒时间分析，随着代次的增加，收毒时间逐渐在缩短，而细胞颗粒饱满时间基本稳定在8.5 h～11.5 h 范围内。

从表3低剂量组数据分析可知，以1 %种毒含量进行接毒传代，种毒LD50基本在7.0～8.0范围内变化，而且通过收毒时的观察，SY001 F10代毒价不合格，通过后续连续传代，收毒时间缩短毒价升高，可以初步证明，用低剂量接毒方法可以盲传两到三代，毒价基本趋于合格。说明这种传代方法可以达到生产的要求，而且这种工艺有一定的可行性。经表2与表3对比分析可知，正常剂量组与低剂量组种毒传代方式最大的不同，种毒含量高收毒时间快，种毒含量低收毒时间慢，即种毒含量的多少与收毒时间呈一定的正相关性，测毒结果与细胞病变情况，两种方式基本一致。

2.3 贴壁种毒不同保存方式对种毒质量的影响

从表4、图2可知，不论是4 ℃平稳保存和还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价匀有不同程度的损失；从保存条件分析，4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式。从毒价高低分析可知，在大部分保存时间内，在 4 ℃下保存，高毒价的下降率明显低于4 ℃低毒价的下降率，而-20 ℃保存方式也有上述规律，这就说明，保存方式和毒价高低影响贴壁种毒的质量。

3 讨论

3.1 BHK-21细胞贴壁状态及传代稳定性对筛选种毒质量的影响

细胞培养时间、分种比例、细胞营养液以及不同种类的血清与添加量，均能影响贴壁细胞状态与形态。而本次试验在固定分种比例、营养液以及血清因素同时，只考虑细胞培养时间对筛选种毒支系的影响，旨在探讨细胞培养时间与种毒质量的关联性。在实际工作中，细胞状态是指细胞的致密程度、融合率及细胞肉眼观察情况状。细胞状态影响收毒时间的变化，同时也一定程度上影响LD50毒价的变化。一般情况下，不同培养阶段BHK-21细胞，细胞的致密度与薄厚度不一致；在接毒量一致的情况下，细胞培养时间会影响CPE收获时间，从而间接地影响毒价。在实际工作中，尽量选择细胞形态好，培养时间在48 h～72 h细胞进行接毒，同时在工作中加无菌观念意识，在一定程度上，利于筛选优质的种毒。

3.2 不同的接种比例对筛选种毒的影响

在细胞状态良好，细胞培养时间一定的情况下，贴壁种毒接毒含量增高，收获时间缩短，反之亦然。经报道，接毒量高低直接影响病毒繁殖周期，细胞病变快慢直接影响细胞维持液的酸碱度及营养物质的消耗快慢，这些因素的变化会直接影响完整病毒粒子的情况。通过本次试验结果可知，低剂量、正常剂量接毒传代试验均能获得合格的种毒支系。因此，在实践中，适宜地改变接毒量有助于提高种毒毒价。所以，在种毒传代中多注意上述问题。

3.3 贴壁病毒液的不同保存条件对种毒质量

的因素的影响

在口蹄疫灭活疫苗制备过程中，不可避免地要将基础种毒、抗原灭活液、成品苗进行保存，选择适宜的保存条件和储备方法，对疫苗质量的提高有一定的指导意义。大量资料报道表明[6]，冷链系统是口蹄疫苗的主要储存和运输方式，可见如何有效地保存疫苗终端产品也是疫苗质量提高的关键。本次试验证明，不论是 4 ℃平稳保存和还是-20 ℃冷冻保存，随着保存时间的延长，毒价匀有不同程度的损失，而且4 ℃保存的毒液下降率明显低于-20 ℃保存方式，本次结果与一些报道有所差距。经查阅资料分析有如下原因所致，因為在保存口蹄疫抗原或毒液时，大部分采用的是缓冲体系来保存，在4 ℃或 -20 ℃保存条件下，-20 ℃保存条件下更容易使缓冲体系酸碱度发生变化，从而使毒液中的完整病毒粒子更容易降解，影响口蹄疫病毒质量。

4 结语

综上所述，疫苗制备过程是一个系统过程，本次试验只是从种毒方面初步探讨了，细胞培养时间的变化、接毒量的变化以及毒液保存条件的改变对贴壁种毒质量的影响，基本得出如下结论细胞状态、保存时间是影响口蹄疫种毒质量的关键。因此，在实际工作中细化这方面的研究，对口蹄疫疫苗质量的提高会有一定的指导意义。□□

参考文献：（6篇，略）