超高效液相色谱－串联质谱法检测牛奶中7种氨基糖苷类药物残留

刘雪红，张秀芹，侯 颖，乔 颖，宋 平，马晓建，季 磊，戚 骥

(1.大连市兽药饲料监察所，辽宁大连116037;2.辽宁省兽药饲料监察所，沈阳110000)

氨基糖苷类抗生素(aminoglycosides，AGs)，是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强的碱性抗生素。具有静止期杀菌作用，对革兰氏阴性和阳性菌均有很好的抑杀作用，属于广谱抗生素［1］。由于高效和低价，其广泛应用于养殖业中，常被用在奶牛养殖过程中，用来治疗奶牛的多种疾病［2］。氨基糖苷类抗生素在动物性食品中的残留对人体具有潜在危害，可引起听力减退、耳鸣或耳部饱满感等耳毒性反应以及肾毒性反应等。农业部公告第235号［3］规定了氨基糖苷类抗生素在动物源性食品中的限量要求。

目前，AGs药物残留的检测方法主要有微生物法［4］、免疫分析法［5］、液相色谱法［6］及液相色谱 －串联质谱法［7－8］。微生物法检测周期长，专属性差;免疫分析法样品前处理简单、检测速度快，但容易产生假阳性或假阴性的结果;液相色谱法需要衍生化，操作较为繁琐，稳定性差。液相色谱一串联质谱法是应用较广泛的检测此类抗生素的方法。AGs易溶于水，极性强，在C18柱上保留弱，文献报道较多的是在流动性中加入离子对试剂——七氟丁酸、五氟丙酸等［9］，增强其在柱上的保留。本文采用CORTECS HILIC色谱柱，甲酸铵溶液作流动相，避免了离子对试剂、仪器的污染。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备 电子天平RD－200，德国 Sartorius公司;高速冷冻离心机Sigwa2K15，sigma公司;强力漩涡混和器REAX top，德国Heidolph;台式酸度计FE 20，瑞士梅特勒;XEVO TQ－S ACQUITY UPLC超高效液相色谱－串联质谱仪，配置电喷雾离子源，美国Waters公司;色谱柱ACQUITY CORTECS HILIC 100 mm×2.1 mm ×1.6 μm，Waters公司;固相萃取柱:WP CBX(500 mg/6mL)，J.T.Baker公司。

1.2 药品与试剂

1.2.1 标准品 链霉素批号 CA16974900、含量99.0%，双氢链霉素批号C12635300、含量99.0%，庆大霉素批号C14000200、含量94.4%，卡那霉素批号C14505520、含量90.0%，丁胺卡那霉素批号C10164000、含 量 90.0%，安 普 霉 素 批 号C10293000、含 量 81.5%，大 观 霉 素 批 号C16972700、含量90.0%，均为德国 Dr.Ehrenstorfer公司产品。

1.2.2 试剂 乙腈、甲酸、甲醇为色谱纯;水为符合GB/T 6682规定的一级水;乙酸、甲酸铵为优级纯;乙酸铵、盐酸、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠、三氯乙酸、氢氧化钠为分析纯。

乙酸铵缓冲液的浓度C乙酸铵=10 mmol/L:称取0.77 g乙酸铵，加入900 mL水，用1 mol/L盐酸调节pH 为4.0，再加入0.15 g乙二胺四乙酸二钠、5 g氯化钠和20 g三氯乙酸，混匀，加水至刻度即得。

1.2.3 标准贮备液的配制 准确称取链霉素、双氢链霉素、庆大霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、安普霉素、大观霉素标准品各25 mg，以水定容至25 mL，混匀，即为1000 μg/mL的标准贮备液;4℃避光保存于塑料试管中，有效期为3个月 (AGs易与玻璃制品发生吸附，实验过程中尽量都使用塑料制品)。然后用70%乙腈溶液逐步稀释成适当浓度的混合标准工作液，保存于塑料试管中。

1.3 测定方法

1.3.1 样品处理 称取2 g(精确到0.01 g)均质样品，置于50 mL离心管中，加入10 mL乙酸铵缓冲液，涡旋振荡提取，10000 r/min离心5 min，倒出上清液，5 mol/L 氢氧化钠调 pH 至7.5±0.5，混匀。用5 mL甲醇和5 mL水活化CBX柱(500 mg/6mL)，将提取液过柱，5 mL水淋洗，用3 mL 10%乙酸甲醇溶液洗脱，40℃氮气吹干［10］。加入0.4 mL 70%乙腈溶液，充分涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，上机待测。

1.3.2 液相色谱条件 柱温30℃，进样量5 μL，流动相:A为200 mmol/L甲酸铵水溶液(pH 2.5)，B为150 mmol/L甲酸铵(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0);梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序表

1.3.3 质谱条件 离子扫描方式:正离子，检测方式:多反应监测，雾化器压力0.7 MPa，干燥气流量1000 L/h，干燥气温度550℃，毛细管电压3000 V，定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量见表2所示。

表2 7种AGs药物定性、定量离子对和锥孔电压及碰撞能量表

1.3.4 标准曲线绘制 精密量取2 μg/mL混合标准工作液 0.02、0.04、0.10、0.40、1.00 mL，分别添加到2 g空白牛奶中，按1.3.1项处理，得到浓度分别为0.1、0.2、0.5、2、5 μg/mL 的基质匹配标准曲线溶液。

2 结果

2.1 标准曲线 以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，基质匹配标准溶液浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线(表3)。7种AGs药物在0.1～5 μg/mL的范围内线性关系良好，相关系数均在0.996以上(表3)。

2.2 检测限和定量限 添加适量混合标准工作液于空白牛奶中，经提取后测定。根据特征质量色谱峰的信躁比S/N＞3为检测限，信躁比S/N＞10为定量限，检测到7种AGs药物的检测限为10 μg/kg，定量限为 20 μg/kg。空白牛奶中添加 20 μg/kg的7种AGs药物特征离子质量色谱图见图1。

2.3 回收率及重复性试验 在空白牛奶中添加3个不同浓度(20、50、200 μg/kg)7 种 AGs药物，进行回收率试验，每个添加浓度做5个平行，连续测定3批，其平均回收率、相对标准偏差见表4。从表中试验结果可以看出7种药物的添加回收率在80%～117.5%之间，批内批间相对标准偏差均小于15%。

表3 7种AGs药物的标准曲线及相关系数表

图1 空白牛奶中添加20 μg/kg的7种AGs药物特征离子质量色谱图

表4 7种AGs药物回收率及重复性试验结果表 (n=5)

3 讨论与小结

3.1 样品处理条件的选择 该类药物溶于水，采用低pH缓冲液可有效提取，同时加入三氯乙酸除蛋白质。已报道的固相萃取柱有羧基柱(CBX)、C18柱、亲水亲脂平衡柱(HLB)等，本方法采用CBX柱，达到了满意的效果。

3.2 色谱条件的选择 流动相中添加改性剂，增加药物在柱上的保留。甲酸铵水溶液－乙腈是HILIC常用的流动相［11］，因此考察不同浓度甲酸铵溶液对色谱峰形的影响。最终确定200 mmol/L甲酸铵水溶液(pH 2.5)、150 mmol/L甲酸铵(乙腈∶甲醇∶水=60∶10∶30)溶液(pH 4.0)作为流动相，同时优化了梯度洗脱程序，得到了分离度以及对称因子均较好的峰形。AGs药物极性强，在C18柱上保留弱;亲水作用色谱柱，可以有效的延长保留时间，同时HILIC色谱柱使用的高比例挥发性有机相亦有助于质谱响应值的提高。选择ACQUITY UPLC BEH HILIC和ACQUITY CORTECS HILIC两种色谱柱进行比较，结果发现采用 ACQUITY CORTECS HILIC色谱柱时，待测物的灵敏度和峰型都比较好。

3.3 基质效应研究 由于液相色谱－串联质谱存在基质效应［12－13］，而且乳品样品基质复杂，含有大量的内源性化合物，因此对样品基质效应进行研究。比较3个不同条件下的信号峰面积:纯的标准品溶液，样品基质提取后添加，样品基质提取前添加。在优化实验条件下，用空白样品按1.3.1项方法制作空白基质吹干后，加入一定量标准溶液，制成基质标准溶液;在空白样品中加入一定量标准溶液，按1.3.1项方法制成基质匹配标准溶液;与相应浓度的纯标准溶液比较。实验结果发现，基质效应明显，因此定量时采用基质匹配标准曲线。

3.4 进样溶液的选择 选择水、150 mmol/L甲酸铵70%乙腈溶液、70%乙腈为进样溶液。采用水为进样溶液时，卡那霉素、丁胺卡那霉素、大观霉素峰展宽且峰形不对称;采用150 mmol/L甲酸铵70%乙腈溶液时，上述药物峰形对称，但峰展宽;70%乙腈为进样溶液，峰形对称而尖锐。最终确定70%乙腈作为进样溶液。

本方法确立的用超高效液相色谱－串联质谱技术，可同时检测牛奶中7种AGs药物残留，满足其限量要求。样品处理简单，快速，检测方法准确、可靠。

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