人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病模型大鼠脑片磷酸化Tau蛋白及胆碱乙酰基转移酶表达的影响

李 源 刘 颖 袁海峰 马新欣 张 欣 李 明 侯吉星 权乾坤 李 玺

(西安电力中心医院，陕西 西安 710032)

阿尔茨海默病(AD)病理改变主要包括老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)和神经元丢失等〔1～3〕。tau蛋白异常磷酸化是导致神经元纤维缠结发生的原因之一。神经递质乙酰胆碱的含量会随着年龄的增加而下降，而老年痴呆患者下降更为严重〔4〕。因此，胆碱乙酰基转移酶(ChAT)的活性也反映了胆碱能神经元的活性和AD的严重程度。人参皂苷Rg1是人参皂苷中最主要的成分之一，具有促进海马神经发生、提高神经可塑性、增强学习、记忆力等作用〔5〕，提示Rg1对AD治疗有着重要的潜在价值。但目前，关于人参皂苷Rg1对磷酸化tau(P-tau)蛋白及ChAT的影响国内外均未见研究报道。本研究以冈田软海绵酸(OA)诱导大鼠脑片tau蛋白过度磷酸化制备AD模型，观察人参皂苷Rg1对P-tau蛋白、ChAT的表达的影响，旨在阐明人参皂苷Rg1抗痴呆的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠10只(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，清洁级，鼠龄:5 w;体重:110～130 g;合格证号为SCXK(陕)2007-001。

1.2 药品及试剂 人参皂苷Rg1，纯度98.99%，吉林宏久生物科技股份有限公司产品;OA，纯度98%，美国ALEXIS生物制剂公司产品;P-tau(Sere202)一抗ChAT一抗，辣根酶标记二抗，武汉博士德生物工程有限公司产品;PVDF膜及DAB染色试剂盒购自北京博奥森生物工程有限公司。

1.3 仪器 振动切片机(上海之信仪器有限公司，型号:ZQP-86);紫外分光光度仪(日本岛津，型号:UV-260);蛋白电泳仪(美国BIO-RAD，型号:迷你型-3);凝胶成像图像分析仪〔意大利 Segrate(Milan)〕。

1.4 方法

1.4.1 AD模型大鼠脑片模型的制备、分组及干预 将大鼠麻醉，快速断头，取出脑组织，行冠状切片，取海马及皮层脑片置入盛有人工脑脊液的6孔板中培养。整个过程持续通入混合氧气(95%O2+5%CO2)，温度始终保持低于4℃。每只大鼠平均取400μm厚海马及皮层脑片5张，随机分为五组:空白对照组、模型组、人参皂苷Rg1高、中、低浓度组。各组脑片首先至于人工脑脊液中不做任何处理恢复1 h;然后Rg1高、中、低浓度组分别加入Rg1致使其终浓度为240、120、60μmol/L，培养至2 h;然后将OA加入模型组和人参皂苷R1各组中，致使其终浓度分别为1μmol/L，作用3 h，空白对照组不加任何处理。

1.4.2 Western印迹 干预结束后，将脑片取出匀浆，充分裂解后离心分离，定量分装。采用不连续SDS-PAGE法，将提出的总蛋白经电泳仪电泳在分离胶上展开、转膜/印，经多次封闭、漂洗后，用待测目的蛋白的一抗(P-tau抗体浓度200μg/ml、ChAT抗体浓度200μg/ml)与PVDF膜上的蛋白质相互作用，再与辣根酶标记的ChAT、P-tau第二抗体作用。采用DAB法显色，用PBS做阴性对照。

1.4.3 图像分析与检测 通过二抗上的标记酶与底物的反应呈色，用凝胶成像分析仪对各组蛋白条带表达情况进行灰度值扫描分析，分别检测各组P-tau、ChAT阳性表达的情况，然后以各组条带所测平均灰度值与β-actin的灰度值的比值，表示该组阳性物质的表达量，采集10组数据，求均值。

1.5 统计学方法 数据采用x±s表示，使用SPSS13.0软件进行单因素方差分析法及LSD-t检验。

2 结果

2.1 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片P-tau表达的影响与空白对照组比较，模型组P-tau表达显著增加(P＜0.01)。与模型组比较，人参皂苷Rg1各浓度组P-tau表达均显著减少(P＜0.01)，其中高浓度组P-tau表达减少最为明显，其次为中、低浓度组。见表1、图1。

2.2 人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片ChAT表达的影响 与空白对照组比较，模型组ChAT表达显著减少(P＜0.01)。人参皂苷Rg1各浓度组与模型组比较，ChAT表达均显著增加(P＜0.01);高浓度组较中浓度组ChAT表达增加更为显著(P＜0.01)，中浓度组较低浓度组表达增加(P＜0.01)。见表1、图2。

表1 人参皂苷Rg1对AD大鼠脑片P-tau、ChAT表达的影响(x ± s，n=10)

图1 各组大鼠脑片P-tau的表达

图2 各组大鼠脑片ChAT的表达

3 讨论

AD即老年性痴呆是以进行性记忆和认知功能丧失为临床特征的大脑退行性疾病。研究提示，Tau蛋白异常磷酸化在AD患者神经变性和学习记忆障碍的发生发展中起重要作用〔6，7〕。OA是一种海洋生物提取物，研究证实，在体内或体外条件下，OA可通过联结催化亚单位以及甲基化抑制磷酸酯酶活性并引发tau蛋白异常的磷酸化这一AD关键环节〔8〕，而tau蛋白异常磷酸化会使其结合组装微管的生物学功能降低，进而致微管解聚。由于微管在神经细胞的轴浆运输、极性维持等生理活动中具有重要作用，所以，tau蛋白过度磷酸化会严重阻碍细胞的正常生理功能，最终导致神经细胞退化，产生或加重AD病情〔9〕。AD患者脑中ChAT的活性反映了胆碱能神经元的活性和病情的严重程度。本实验结果表明，OA处理的模型组大鼠ChAT阳性表达数量显著减低。考虑这一机制可能正是由于OA使海马及皮层神经元中tau蛋白过度磷酸化，影响了启动微管组装的微管蛋白-β亚单位与GTP结合的反应，降低了微管组装能力，损害了轴浆流，致使胞体和神经末梢之间的营养物质和递质的运输受到影响，使ChAT不能运输到海马及皮层，导致AD模型大鼠脑片产生ChAT阳性表达数量显著减低的变化，最终影响到海马和皮层神经元的形态和功能。

人参皂苷被认为是人参的主要有效物质，约占4%。根据皂苷元的不同，人参皂苷被分为原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷及齐墩果酸类皂苷。到目前为止，已分离鉴定出40余种人参皂苷单体。近年来，人参皂苷Rg1、Rg2、Rb1等单体治疗AD的研究已获得一定的突破〔10〕，其中，人参皂苷Rg1的相关研究已经显示出对AD的预防和治疗有一定的作用〔11，12〕。但其机制有待进一步探讨。

本实验结果证实人参皂苷Rg1可以减少AD模型大鼠脑片P-tau的表达，同时增加胆碱能系统中乙酰胆碱的合成和释放，增强脑突触受体对胆碱的提取，提高大鼠ChAT的活性发挥抗AD的作用。并发现该作用具有明显的剂量依赖性。考虑其可能的机制是人参皂苷Rg1对抗了OA选择性抑制蛋白磷酸酯酶这一作用，保持了蛋白激酶和磷酸酯酶的动态平衡，使得tau蛋白异常磷酸化的数量减少，确保微管组装能力不受损害，进而保障了胆碱能系统中Ach的合成和释放，维持脑中ChAT的正常水平。总之，人参皂苷Rg1可能通过抑制Tau蛋白磷酸化及促进ChAT的表达，从而发挥抗痴呆作用。

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