番茄红素解除PM2.5暴露内皮细胞的氧化损伤

陈文生 孙灿兴 戴建威

(广州医科大学生物技术系，广东 广州 511436)

PM2.5主要来源是人为排放〔1〕，能对呼吸系统和心血管系统造成伤害〔2〕，长期暴露于PM2.5中人群心血管事件发生和死亡风险显著升高〔3〕。对比于婴儿、青年，PM2.5对老年人的健康影响最大〔4〕，其可能是影响社区老年人健康的主要污染物〔5〕。番茄红素是成熟番茄的色素，属烃类胡萝卜素〔6〕，是强力抗氧化生物活物质〔7〕，对防治前列腺炎、前列腺癌、肺癌、胃癌、乳癌有奇效，对预防心脑血管疾病有显著效果〔8〕。目前国内对于番茄红素的研究大多局限于分离纯化方面。本实验拟探讨番茄红素是否有解除PM2.5暴露下脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)氧化损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 HUVEC细胞购自美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞库;脂质氧化丙二醛(MDA)检测试剂盒、总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒、八肽胆囊收缩素(CCK-8)试剂盒购自碧云天公司;人白细胞介素(IL)-6 ELISA试剂盒购自博士德公司;PM2.5颗粒物样品于2013年6～11月于北京三环内收集;番茄红素购于Sigma公司;兔抗人缺氧诱导因子(HIF)-1α单克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔抗体购自博士德公司;qPCR检测试剂盒购于TAKARA公司。

1.2 方法

1.2.1 最适番茄红素浓度及作用时间 用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中，取稳定生长的HUVEC细胞，以5 000个细胞/100μl的浓度接入96孔细胞培养板，待细胞贴壁伸展开后，设立4个实验组，分别给予不同浓度番茄红素(0、40、80、160μg/ml)刺激无 PM2.5暴露HUVEC细胞12、24 h;不同浓度番茄红素刺激PM2.5暴露HUVEC细胞12、24 h。每组设3个复孔，加入CCK-8溶液后0.5 h测定OD值。PM2.5暴露浓度根据本实验室已有结果80μg/ml为最佳刺激浓度进行实验操作。

1.2.2 总SOD活性检测 细胞接种后设立空白对照组、番茄红素组、PM2.5组、番茄红素+PM2.5组，每组2个复孔，实验药物作用浓度、时间依据最适番茄红素作用浓度时间结果，选择80μg/ml番茄红素刺激24 h。实验操作参照总SOD活性检测试剂盒说明书进行。

1.2.3 检测细胞MDA含量 细胞分组同1.2.2，每组3个复孔，实验操作参照MDA检测试剂盒说明书进行。

1.2.4 IL-6 mRNA表达情况 细胞分组同1.2.2，每组2个复孔，提取总 RNA，核酸定量仪检测浓度，RT-PCR产物进行q-PCR，每组3个复孔。基因的引物均通过Primer Premier 6设计完成，由上海生工生物工程公司合成。IL-6上游引物:5'-TGAGAGTAGTGAGGAACAAG-3'，下 游 引 物:5'-CGCAGAATGAGATGAGTTG-3'。β-actin上游引物:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'，下游引物:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'。qPCR总反应体系20μl:SYBR®Premix Ex TaqTM(2×)10μl、上下游引物各 0.4μl、ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μl、DNA模板1μl，加入无菌双蒸水至反应总体积为20μl。在同一反应体系对目标基因和β-actin同时进行qPCR，预变95℃ 30 s，1 个循环;PCR 反应95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 个循环;溶解曲线分析 95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.2.5 IL-6蛋白表达情况 细胞分组同1.2.2，实验操作参照人IL-6 ELISA试剂盒说明书，每组3个复孔。

1.2.6 Western印迹检测 HIF-1α蛋白表达 细胞分组同

1.2.2，提取细胞总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定浓度，每泳道20μl总蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDSPAGE)凝胶电泳，蛋白转膜后5%脱脂奶慢摇封闭3 h，孵育一抗、二抗，曝光结果采用Quantity One软件分析。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0软件行单因素ANOVA分析。

2 结果

2.1 最适番茄红素作用浓度、时间检测 在PM2.5与番茄红素共同作用下，12 h组别中细胞的OD值与浓度无依赖性，各组间OD值无显著差异(P＞0.05);24 h组别中，PM2.5+0μg/ml番茄红素组、PM2.5+80μg/ml番茄红素组OD值分别与空白对照组OD值有显著差异(P值分别为0.044，0.009 8)，得出80μg/ml番茄红素作用下PM2.5造成的细胞毒性最小，作用最佳时间为24 h，后续实验操作所用番茄红素浓度都为80 μg/ml，PM2.5浓度都为80 μg/ml。见表1。

表1 番茄红素浓度及处理时间优化(x ± s，n=3)

2.2 SOD活性检测 番茄红素组SOD活性最大(0.105 2)，PM2.5组SOD活性最小(0.039 9)，空白对照组与番茄红素+PM2.5组分别为0.054 6、0.059 1。番茄红素组与番茄红素+PM2.5组SOD活性对比，升高48.04%(P＜0.01);空白对照组、PM2.5组与PM2.5+番茄红素组SOD活性无明显差异(P＞0.05)。

2.3 MDA检测 PM2.5组MDA含量(5.202)较番茄红素+PM2.5组(3.179)显著升高52.35%(P＜0.05);番茄红素组MDA含量(1.734)较番茄红素 +PM2.5组(1)显著降低38.89%(P＜0.05)，空白对照组MDA含量(3.179)与番茄红素+PM2.5组无明显差异(P＞0.05)。

2.4 IL-6表达情况 PM2.5组细胞IL-6 mRNA表达量(1.8)较番茄红素+PM2.5组(1)显著升高80%(P＜0.01)，番茄红素组细胞IL-6 mRNA表达量(0.75)较番茄红素+PM2.5组显著降低25%(P＜0.05)，空白组细胞IL-6 mRNA表达量(1.25)较番茄红素+PM2.5组显著升高25%(P＞0.05)。

空白对照组IL-6蛋白含量(4.592)与番茄红素+PM2.5组(4.762)比较无明显变化;番茄红素组(4.293)较番茄红素+PM2.5组降低9.8%(P＜0.05);PM2.5组含量(5.363)较番茄红素+PM2.5组升高12.6%(P＞0.05)。

2.6 HIF-1α表达情况 番茄红素组(0.553 1)较番茄红素+PM2.5组(0.765 2)细胞的 HIF-1α表达量显著降低27.7%(P＜0.05)，PM2.5组细胞的HIF-1α表达量(0.881 3)较番茄红素+PM2.5组细胞的HIF-1α表达量显著升高15.2%(P＜0.05)。空白对照组HIF-1α表达量为0.726 9。见图1。

图1 不同处理后HUVEC细胞HIF-1α条带

3 讨论

氧化损伤被认为是引起癌症和心脑血管疾病发病增加的主要原因之一，PM2.5对心脑血管损伤，尤其是对老年人的心脑血管损伤甚为严重。番茄红素的体外抗氧化能力已得到许多实验证实，其抗氧化作用是β-胡萝卜素的2倍多，是维生素E的100倍〔9〕。自由基损伤的特点是破坏防御酶系统，大量消耗SOD，而SOD恰恰是机体清除自由基的重要抗氧化酶，是自由基损害的主要防御酶。脂质过氧化作用参与了心肌缺血缺氧的过程。血清中SOD活性下降及过氧化脂质代谢产物MDA含量显著升高是反映心肌缺血缺氧程度的重要标志〔10〕，本研究结果显示，番茄红素的抗氧化作用能解除因PM2.5暴露造成的细胞氧化损伤。此外，PM2.5对细胞有明显的氧化作用，番茄红素有较强的抗氧化作用和对PM2.5暴露的细胞有显著的解除氧化损伤作用。

IL-6为炎症细胞因子，机体氧化损伤后会引发炎症，促使细胞产生和分泌炎症细胞因子;同样，HIF-1α是缺氧诱导因子，只有在缺氧条件下才可稳定表达，其表达与缺氧适应、炎症发展及肿瘤生长等相关，因此，检测IL-6和HIF-1α的表达量将从炎症的角度解释番茄红素抗氧化作用的机制。本研究结果显示PM2.5能使细胞IL-6表达显著升高，同时，番茄红素的作用能解除PM2.5上调IL-6表达的现象。IL-6变化后，细胞HIF-1α表达量随后也发生了显著变化，PM2.5能上调细胞HIF-1α的表达，而番茄红素具有解除PM2.5上调HIF-1α表达的作用。

综上，番茄红素能通过IL-6/HIF-1α通路有效解除PM2.5暴露对内皮细胞的损伤作用，对于因暴露PM2.5而患心脑血管疾病的敏感群体老年人，番茄红素可能有治疗作用。

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