清利活血汤配合三黄生肌纱条对糖尿病足溃疡大鼠血浆及肉芽组织中白介素-1、内皮素-1及一氧化氮含量的影响

段旭东 赵 辉 高 璇 张雅兰 王晓媛

(河北医科大学第二医院外科，河北 石家庄 050000)

糖尿病足(DF)溃疡最常见的是难以愈合的足部溃疡。目前普遍认为DF是一个全身性疾病，它既有内科疾病的临床表现，又有肢端溃烂，局部感染等外科疾病的症状和体征，所以在其治疗上，要重视内外科综合治疗〔1〕。我科采用清利活血汤配合三黄生肌纱条治疗DF多年，取得了良好的临床疗效。本实验观察二者对DF溃疡大鼠血浆及肉芽组织中白介素(IL)-1、内皮素(ET)-1、一氧化氮(NO)含量的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雄性Wistar大鼠32只，体重180～220 g，由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号:1103043，室温20℃饲养，自由进食水。

1.2 药物

1.2.1 清利活血汤 黄芪20，山药15 g，当归12 g，桃仁9 g，红花 9 g，川芎 9 g，山楂 6 g，生地 9 g，玄参 20 g，苍术 9 g，银花12 g，黄连6 g，土元6 g，鱼腥草15 g，上药加水1 000毫升，浸泡2 h，武火煮开，文火煎煮15 min，将药液倒出，加水500 ml，煎煮15 min，将药液倒出与第一次药液混合，使用前浓缩成含2.42 g生药/ml的混悬液。冷藏保存。

1.2.2 三黄生肌纱条 黄连、黄柏、姜黄、当归各15 g，生地30 g等，麻油500 g浸药3 d微火煎熬至药枯，去药渣后加入黄蜡30 g，微火化开，浸入灭菌纱布条，低温储存待用。

1.2.3 盐酸二甲双胍片 北京中惠药业有限公司产品，批准文号:国药准字H19983069。批号20101112，0.25 g/片。

1.3 主要仪器及试剂 高压液相分析，VARIANT-2美国伯乐公司产品。酶联免疫检测仪，MK3，芬兰雷勃公司产品。全自动洗板机8×12，美国宝特公司产品。电热恒温水箱，600型，天津泰斯特公司产品。可见光分光光度计，722型，上海分析仪器厂产品。超低温保存箱，MDF-382E，日本 SANYO公司产品。高速冷冻离心机，1-15 K，美国Sigma公司产品。电动玻璃匀浆机，DY89-1，宁波新芝生物科技股份有限公司产品。高性能无菌实验台，DL-CJ-1N，哈尔滨东联电子技术开发有限公司产品。电子天平，HM-200，日本岛津公司产品。链脲佐菌素(STZ)，Sigma公司产品，批号S-0130。

1.4 分组及模型建立 大鼠随机分为四组，每组8只，随机抽取1组为正常组，普通饲料喂养，余组高脂饲料喂养，4 w后禁食不禁水16 h，一次性腹腔注射低剂量 STZ 30 mg/kg(用pH4.4的无菌柠檬酸缓冲液配成0.25%浓度);正常对照组腹腔注射等体积的0.1 mol/L无菌柠檬酸缓冲液，72 h后断尾取血，测定血糖，血糖＞16.65 mmol/L者为成模大鼠，选取糖尿病大鼠按照血糖随机分为模型组、清利活血汤治疗组(治疗组)、二甲双胍治疗对照组(对照组)，每组8只。四组动物在空腹8 h后均以10%水合氯醛1 ml/100 g体重腹腔注射麻醉，背部剃毛，常规消毒，用打孔器于大鼠背部脊柱左侧相同部位打孔(φ2 cm)，溃疡深及筋膜层，止血，以相同大小塑料环缝于皮肤上以阻止皮肤收缩，无菌纱布包扎，分笼饲养，自由饮水与进食，用药期间所有糖尿病大鼠继续以普通饲料喂养。

1.5 用药 治疗组及对照组均从模型建立后第1天开始灌胃给药，2 ml/次，1 次/d，共 15 d，用药剂量按有关公式〔2〕，将人临床用药剂量折算为大鼠用药剂量，模型组、正常组均生理盐水灌胃，2 ml/次，1次/d，共15 d。各组大鼠均从手术后第1天起，每日清创1次，祛除创面上硬痂，常规消毒，用生理盐水冲洗创面。治疗组以三黄生肌纱条外敷，对照组用凡士林纱条外敷，正常组、模型组以生理盐水纱条外敷。创面外用无菌纱布包扎，胶布固定。

1.6 检测样品的制备

1.6.1 肉芽组织匀浆的制备 分别取肉芽组织2 g生理盐水冲洗3次，剪碎后移入高速匀浆器中，加入4℃生理盐水4 ml，高速研磨2 min，使组织充分匀浆，制备好的匀浆置离心机3 000 r/min离心15 min，提取上清液备用。

1.6.2 血浆的制备 10%水合氯醛1 ml/100 g腹腔内注射麻醉后，切断大鼠右股动脉取血，2 000 r/min离心2 min分离血浆备用。

1.7 检测指标及方法

1.7.1 糖化血红蛋白 (HbA1c)测定 各取2 ml大鼠血置EDTA抗凝管内，采用高压液相法测定HbA1c含量。

1.7.2 血浆及肉芽组织IL-1、ET-1的测定 采用放射免疫法，分别取肉芽组织匀浆及血浆0．1 ml，先由自动γ-放射免疫计数器预先编制程序，直接给出标准曲线及浓度，然后分别测定IL-1、ET-1含量，同时测得组织匀浆上清液蛋白含量。

1.7.3 血浆及肉芽组织 NO测定 分别取样品0.3 ml，按试剂盒要求步骤操作，最后置紫外可见分光光度计550 nm、0.5 cm光径检测各管吸光度值。

1.8 统计学处理 数据采用x±s表示，用STATA8.0统计软件，进行单因素方差分析及q检验。相关分析采用直线相关性检验。

2 结果

2.1 大鼠HbA1c的变化 与正常组比较，模型组大鼠HbA1c明显增高〔(18.15±1.86)%vs(6.48±1.28)%，P＜0.01〕，与模型组比较，治疗组〔(12.88±2.77)%〕及对照组〔(15.01±1.64)%〕HbA1c均明显降低(P＜0.01)，治疗组HbA1c较对照组低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 大鼠血浆及创面肉芽组织IL-1含量的变化 表1可见，与正常组比较，模型组大鼠血浆及肉芽组织中IL-1含量明显增高(P＜0.01)，与模型组比较，治疗组及对照组IL-1均较模型组明显降低(P＜0.01);与对照组比较，治疗组血浆及肉芽组织中IL-1明显降低(P＜0.05)。见表1。血浆与肉芽组织中IL-1显著正相关(r=8.10，P＜0.01)。

2.3 大鼠血浆及创面肉芽组织ET-1含量的变化 与正常组比较，模型组大鼠血浆及肉芽组织中ET-1含量明显增高(P＜0.01);与模型组比较，治疗组及对照组ET-1均较模型组明显降低(P＜0.01)，与对照组比较，治疗组血浆及肉芽组织中ET-1明显降低(P＜0.01)。见表1。血浆与肉芽组织中ET-1显著正相关(r=10.406，P＜0.01)。

表1 各组大鼠血浆、内芽组织IL-1、ET-1、NO含量 (x±s，n=8)

2.4 大鼠血浆及创面肉芽组织NO含量的变化 与正常组比较，模型组大鼠血浆及肉芽组织中 NO含量明显降低(P＜0.01);与模型组比较，治疗组NO含量较模型组明显升高(P＜0.01)，对照组NO含量虽有升高，但差异不具有统计学意义(P＞0.05)，与对照组相比，治疗组NO含量明显升高(P＜0.01，P＜0.05)，见表1。血浆与肉芽组织中 NO显著正相关(r=10.335，P＜0.01)。

3 讨论

溃疡面的修复过程含炎症、增生和修饰三个阶段，有多种细胞、介质、生长因子和细胞外基质等成分的共同参与。研究发现，在DF溃疡中，生长因子和其他伤口愈合所需要的介质发生异常〔3，4〕，从而影响伤口愈合。因此深入研究这些因子在DF溃疡中的变化及作用，有助于揭示溃疡难以愈合的机制。

IL-1是典型的炎症细胞因子，几乎各种有核细胞均能产生，其既担任着内源性免疫防御的重要职能，同时也是参与组织破坏和纤维化的效应分子，不同的情况，不同的细胞，不同的浓度，IL-1的作用可能不同，甚至完全相反〔5〕。研究表明，高血糖可激发IL-1 mRNA自身正反馈机制产生大量IL-1，而大量的IL-1可诱导胰岛β凋亡导致高血糖〔6，7〕，形成恶性循环从而加重糖尿病病情。同时DF溃疡面上IL-1显著增高可抑制了成纤维细胞的增殖，从而使溃疡难以愈合。降低溃疡面上IL-1含量，可加速创面愈合〔8〕。本实验提示清利活血汤三黄生肌纱条促进愈合的机理可能与抑制大鼠体内过度的炎症反应有关。

ET、NO是血管内皮细胞释放的一组作用相反的生物活性因子，对维持血管正常的生理功能(形态、通透性、收缩与舒张功能)起着重要作用。

糖尿病时由于高糖等因素引起血管内皮细胞受损，ET-NO系统失调，并最终导致糖尿病血管并发症的发生〔9，10〕。两者间动态失衡的程度可在一定程度上反映糖尿病患者血管壁的异常，血管内皮细胞损害程度。ET-1是目前已知的作用最强和维持时间最持久的一种缩血管物质。研究表明，血管内皮功能的改变是糖尿病血管并发症的始发因素，高血糖状态会损伤血管内皮细胞引起大量的ET释放〔11〕，从而使局部血管处于持续收缩状态，刺激血管平滑肌细胞增生，血小板凝聚，单核细胞变成泡沫细胞，形成粥样斑块，继发血栓，出现相应的肢体缺血表现。而高血糖所导致的高糖毒性，糖基化终末产物、体内自由基含量增加等因素加速NO灭活及NO活性异常，使NO含量减少，其扩张血管、松弛血管平滑肌和抑制内皮细胞增殖的作用降低。NO正常生理功能的减弱或丧失，可能激活单核细胞、白细胞、血小板向内皮聚集，并加快血小板的凝集，结果导致脂蛋白流入并透过内皮促进平滑肌增殖、血管阻塞〔12〕。近年来的研究提示溃疡面高浓度 ET-1阻碍肉芽生长、溃疡面愈合〔13，14〕。本研究显示清利活血汤加三黄生肌纱条促进愈合的机制可能与减少血管内皮细胞的损伤有关。

DF溃疡属中医“溃疡”、“脱疽”、“消渴”等范畴，中医学认为本病的发病机制主要是消渴日久，气阴两虚，经脉瘀阻，血行不畅，肢端失养，加之湿热下注，久之则肢端坏死。故治疗上应采用益气养阴，活血通络清热利湿的治疗方法，清利活血汤中黄芪、山药、生地益气养阴，当归桃仁、红花川芎养血活血，玄参、苍术、银花、黄连、土元、鱼腥草清热利湿，土鳖虫咸寒归肝经，有破瘀血、续筋骨功效，现代研究表明土鳖虫具有较好的降血糖、血脂作用〔15〕;三黄生肌纱条在我科临床应用多年，具有良好的清热活血生肌敛疮的作用〔16〕。内外相和，清利活血生肌敛疮，可较好地加速DF溃疡面的愈合。

综上，清利活血汤内服配合三黄生肌纱条外用可降低DF溃疡创面血浆及肉芽组织中ET-1、IL-1含量、提高NO含量从而促进溃疡愈合。

1 梁丽荣，谭 岩，赵维彦，等.糖尿病足的病因分析及治疗进展〔J〕．中国老年学杂志，2009;29(2):381-3.

2 陈 奇.中药药理研究方法学〔M〕．北京:人民卫生出版社，1993:33.

3 Medina A，Scott PG，Ghahary A，et al．Pathophysiology of chronic nonhealing wounds〔J〕．JBurn Care Rehabil，2005;26(4):306-19.

4 Dinh TL，Veves A.A review of the mechanisms implicated in the pathogenesis of the diabetic foot〔J〕．Int J Low Extrem Wounds，2005;4(3):154-9.

5 Diarell CA.Biologic basis for interleukin-1 in disease〔J〕．Blood，1996;87(6):411-20.

6 Boni-Schnetzler M，Thorne J，Parnaud G，et al．Increased interleukin(IL)-1beta messenger ribonucleic acid expression in beta-cells of individuals with type2 diabetes and regulation of IL-1beta in human islets by glucose and autostimulation〔J〕．J Clin Endocrinol Metab，2008;93(10):4065-74.

7 Boni-Schnetzler M，Ehses JA，Faulenbach M，et al．Insulitis in type 2 diabetes〔J〕．Diabetes Obes Metab，2008;10(4):201-4.

8 肖正华，周 倩，余绮玲，等.糖尿病足溃疡渗出液中IL-1β动态变化及黄芪提取液外敷治疗〔J〕．广州医学院学报，2008;36(6):11-4.

9 王旭红，宁英远.内皮素、一氧化氮与糖尿病肾病发生发展的关系〔J〕．医学综述，2000;6(4):145-7.

10 李 国.高血糖环境下内皮细胞的损伤〔J〕．生物学教学，2002;27(3):4-5.

11 王 静，张秀娟，张秀敏．老年糖尿病血浆降钙素基因相关肽和内皮素测定的临床意义〔J〕．中国老年学杂志，2001;21(6):431.

12 董 矜，田亚平.一氧化氮代谢异常和糖尿病〔J〕．军医进修学院学报，2004;25(1):74-6.

13 李令根，李日恒，赵 钢，等.康脉3号胶囊对糖尿病足患者内皮素及一氧化氮的影响〔J〕．中国中西医结合外科杂志，2003;9(6):426-7.

14 任校峰，李世荣，王珍祥，等.NO合剂对糖尿病小鼠创面愈合的促进作用〔J〕．第三军医大学学报，2010;32(2):150-3.

15 张 晶，许贵香.土鳖虫对2型糖尿病大鼠模型血糖、血脂的影响〔J〕．第四军医大学学报，2009;30(5):465-7.

16 王晓媛，张雅兰，王自辉，等.中西医治疗对糖尿病足局部组织中细胞因子表达的影响〔J〕．四川中医，2010;28(12):93-5.