球孢白僵菌对假眼小绿叶蝉成虫高致病力菌株筛选

李万里，包亚星，童应华

(福建农林大学 林学院，福建 福州 350002)

假眼小绿叶蝉(Empoasca vitis Gothe)属同翅目(Homoptera)叶蝉科(Icadellidae)小绿叶蝉属(Empoasca spp．)，是中国茶树主要害虫之一［1］。其若虫、成虫均危害刺吸茶树嫩梢芽叶汁液［2］，轻者茶树嫩梢、芽、叶形成褐色斑点，重者导致焦枯［3］。同时，该刺吸性害虫也是茶树病害传播的主要媒介。该虫分布广，世代重叠严重，目前主要以化学防治为主，化学试剂的长期使用使该害虫产生不同程度的抗药性［4］，农药残留降低茶产品的质量。昆虫病原真菌可通过侵入昆虫体壁进入虫体，吸收昆虫体内营养，并释放毒素等致死昆虫，对刺吸式口器的昆虫有较好的效果［5-6］。球孢白僵菌是一种运用广泛的病原真菌，其对鳞翅目、鞘翅目、同翅目以及螨类均有较好的防治效果［7-8］。球孢白僵菌对假眼小绿叶蝉若虫致病力的研究有少量报道［9-10］，但未测定对其成虫的致病力。本研究用不同球孢白僵菌菌株对假眼小绿叶蝉成虫进行致病力测定，旨在筛选出对其具有高致病力的菌株，为该害虫的生物防治提供重要的菌株资源和有效防治途径。

1 材料与方法

1．1 供试虫源

2014年3月下旬至4月中旬，于福建省福州市福建农林大学茶园采集假眼小绿叶蝉。将采回的假眼小绿叶蝉用自制吸虫器吸入透气的广口玻璃瓶内(D=7．2 cm;H=9．6 cm)，以带嫩叶和幼芽的新鲜茶树枝条(5～6 cm)室内饲养。

1．2 供试菌株

供试球孢白僵菌菌株B3、B187系福建农林大学林学院森林保护教研室保存菌株。BLK、BB、BNH-04菌株来源情况见表1。

表1 供试白僵菌菌株来源Tab．1 The origin of tested Beauveria bassiana strains

1．3 孢子悬液的制备

各菌株于PPDA斜面培养基(去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，蒸馏水定容至1 000mL，pH自然，灭菌)上扩大培养，充分产孢后，用10 mL的0．05%Tween 80无菌水洗下，置于振荡器上振荡20 min(180 r/min)。血球计数板计数，将各菌株用0．05%Tween 80无菌水配制成(1±0．5)×107孢子/mL的孢子悬液备用。

1．4 高致病力菌株的筛选

1．4．1 接菌 选择饲养了2 d的健康成虫作为供试虫。采用自制的微型喷菌器，以(1±0．5)×107孢子/mL孢子悬液喷雾法接菌。每个广口瓶装40～50头成虫，置于喷菌器正下方，垂直喷菌3下。并在广口瓶底部放入血球计数板，以同样的方法模拟喷菌，统计单位面积的接菌量。根据统计，单位面积接菌量为(37．0±0．5)孢子/mm2。

1．4．2 试虫饲养 在已灭菌的培养皿中放入酒精瓶盖，瓶盖中以浸泡无菌水的脱脂棉填满，用橡皮筋将鲜嫩茶树枝条(5～6 cm)扎成束后，直插于脱脂棉上，将接菌后的广口瓶倒扣于培养皿中，贴好标签，于(25±1)℃，相对湿度(95±1)%的人工气候箱中饲养，2 d更换1次鲜嫩枝叶，并用浸有无菌水的脱脂棉保湿。每菌株为1处理，每个处理设5个重复，每重复接菌40～50头成虫。每12 h观察和记录1次各处理假眼小绿叶蝉的死亡情况，并及时将死虫转入无菌的培养皿内，用浸泡过无菌水的脱脂棉保湿，置于(25±1)℃的恒温培养箱中培养，观察死虫表面菌丝生长和产孢情况。统计各处理假眼小绿叶蝉死亡数和僵虫数，虫尸上长出可见的菌丝或孢子粉为有效致死，僵虫判断标准参照童应华等［11］和何学友等［12］的方法。以喷等量的0．05%的Tween 80无菌水处理为对照。

1．5 高致病力菌株致死中浓度(LC50)的测定

选择对假眼小绿叶蝉致病力较强，且僵虫率较高的菌株，分别以(1±0．5)×108，(1±0．5)×107，(1±0．5)×106，(1±0．5)×105，(1±0．5)×104孢子/mL 的 5 个浓度梯度孢子悬液，喷雾法接菌，每个浓度梯度5个重复，每个重复测定40～50头健康成虫，以喷0．05%Tween 80无菌水为对照。饲养、观察和记录的方法同 1．4．2。

1．6 数据处理分析

试验数据应用Excel2007处理后，采用DPS7．55数据处理系统进行方差分析和Duncan氏新复极差法多重比较［13］。

采用死亡率—时间几率值分析法，即以时间对数值为X1，校正死亡率转换的几率值为Y1，计算出各菌株线性回归方程和致死中时(LT50)［14］;再以高致病力菌株的孢子悬液浓度对数值为X2，校正死亡率的几率值为Y2，计算出各浓度线性回归方程和致死中浓度(LC50)。

TDM模型的表述如下:

由于累计死亡概率是时间连续的变量，不满足模型模拟的独立性假设，生物学意义不大，而条件死亡概率的计算依赖于完全相互独立的时间区间，它是区间结束时的实际死亡数与区间起始时的存活数之比，满足时间变量的独立性假设。因此，仅考虑不同剂量使试虫在时间区间［ti-1，ti］(i=1，2，……，i)内可能发生的条件死亡概率:

式中:qij表示在时间区间［ti-1，ti］内由剂量dj(j=1，2，……，j)引起的可能发生的条件死亡概率，β表示条件死亡率模型的剂量效应的待估参数(即与剂量效应有关的斜率)，γi表示条件死亡率模型时间区间［ti-1，ti］内的时间效应参数估计值［15-16］。

2 结果与分析

2．1 各菌处理后假眼小绿叶蝉的累计死亡率动态

统计各白僵菌处理假眼小绿叶蝉不同时间段的累计死亡率，结果表明。各菌株对假眼小绿叶蝉均有不同程度的致病力。总体上，各菌株处理第3～7天致死速率较快，死亡高峰期出现在第2．5～5天。其中BLK菌株处理，假眼小绿叶蝉死亡速率较快，处理13 d后，成虫全部死亡(图1)。

图1 不同白僵菌菌株处理后假眼小绿叶蝉的累计死亡率Fig．1 Dynamics of the cumulativemortality rate of Empoasca vitis treated by various Beauveria bassiana strains

进一步比较各菌株处理后3，6，9，12 d的假眼小绿叶蝉累计死亡率，从第3天开始，BLK菌株处理，假眼小绿叶蝉累计死亡率显著高于其它4株菌株。接菌12 d后，假眼小绿叶蝉累计死亡率达(88．67±1．60)%，极显著高于其它4株菌株;其次为 BB菌株处理，成虫累计死亡率为(79．33±1．36)%;最低为BNH-04菌株处理(表2)。

表2 白僵菌处理假眼小绿叶蝉各时段的累计死亡率Tab．2 Cum ulativemortality rate of adult Empoasca vitis treated by various Beauveria bassiana strains

2．2 各菌株对假眼小绿叶蝉的致病力分析

不同菌株对假眼小绿叶蝉致病力的结果见表3。以浓度为(1±0．5)×107孢子/mL的孢子悬液接菌，12 d后，BLK 菌株处理的成虫累计死亡率、校正死亡率、僵虫率分别为(88．67±1．60)%、(86．92±1．96)%、(84．67±0．82)%，均极显著高于其它4株菌株。且各方程拟合程度高并且 R 值均高于0．9，表明所求方程合适。比较各菌株处理的致死中时，BLK菌株处理，成虫致死速度最快，LT50最短，为6．35 d;BB菌株处理后的LT50次之，BNH-04菌株处理后的LT50最长，为9．61 d。

表3 不同白僵菌菌株对假眼小绿叶蝉的致死效果(12 d)Tab．3 The lethal effects of various Beauveria bassiana strains on Empoasca vitis

2．3 白僵菌BLK菌株对假眼小绿叶蝉不同时段的LC50

研究结果表明，BLK菌株对假眼小绿叶蝉成虫有较强的致病力和较高的僵虫率，进一步测定其3，6，9，12 d的LC50，结果见表4。由表可知，各方程拟合程度高并且R值均高于0．9，表明所求方程合适。通过回归方程计算出各时间段的致死中浓度(LC50)，第6天的LC50为9．539×106孢子/mL。)

表4 不同时段白僵菌BLK菌株对假眼小绿叶蝉的LC50 Tab．4 Median lethal concentration(LC50)on different time of the strain BLK to Empoasca vitis

2．4 BLK对成虫的时间－剂量－死亡率模型

建立BLK孢子悬液对假眼小绿叶蝉成虫致病力的时间－剂量－死亡率模型(条件死亡率模型和累计死亡率模型)，获得条件死亡率模型的剂量效应参数β和时间效应参数参数γi(下标i表示处理后第i天)的估计值，继而估计出累计死亡率模型的时间效应参数τi，各参数估计值见表5。经Hosmer-Lemeshow拟合度检验，因 BLK:χ2=0．432 5＜χ20．05(8)=15．507，P=0．999 90＞0．05，即可认为模型拟合中不存在显著异质性，拟合成功。孢子悬液的剂量效应参数β为0．452 2，表明该菌株各浓度的孢子悬液对假眼小绿叶蝉成虫均有一定的致死效果。孢子悬液接菌处理的时间效应参数γi，在接菌2～7．5 d内呈递增趋势，说明在此期间死亡虫数每天都在增加，而在接菌2．5～5 d，其γi较前后均相差较大，间接表明该虫在接菌2．5～5 d死亡数量较多。可见BLK孢子悬液对假眼小绿叶蝉成虫的致死效应在接菌后2．5～5 d较强。随着时间的推移，其累计死亡率模型的时间效应参数逐渐增大，符合真菌对昆虫致病力的特点［17］。

表5 时间－剂量－死亡率模型和参数估计(条件死亡率和累计死亡率)Tab．5 The time-dose-mortality modeling and parameter estimation(conditional and cumulativemortality)

3 结论与讨论

研究发现，5株球孢白僵菌孢子悬液对假眼小绿叶蝉均有一定的致病力。研究结果表明BLK菌株的致病力最强，接菌 12 d后，校正死亡率(86．92±1．96)%，杀虫速度较快，LT50为 6．35 d。因此该菌株在假眼小绿叶蝉生物防治中有重要的应用价值。

应用白僵菌防治假眼小绿叶蝉方面，前人已做了部分研究。濮小英等［18］应用球孢白僵菌纯孢子悬乳剂及其与3%吡虫啉10%可湿剂的混配剂进行假眼小绿叶蝉田间防治试验，其防治效果分别达50%和83．4%;蔡国贵［9］从假眼小绿叶蝉僵虫中分离到1株白僵菌Be2菌株，并选用4株不同来源的球孢白僵菌对假眼小绿叶蝉若虫进行室内致病力测定，结果表明，接菌Be2菌株7 d后，若虫累计死亡率达85．7%;展茂魁等［10］应用孢外蛋白酶活性强，且产酶水平高的3株白僵菌菌株对其若虫进行室内致病力测定，接菌RCEF4687菌株10 d后，若虫死亡率达82．1%。应用白僵菌对假眼小绿叶蝉成虫的室内致病力测定未见报导。本研究应用球孢白僵菌对假眼小绿叶蝉成虫进行致病力测定，筛选出高致病力菌株BLK，其校正死亡率达(86．92±1．96)%。

另外，前人应用其它生物农药防治假眼小绿叶蝉也取得一定成果。田新湖等［19］应用2．5%EC鱼藤酮乳油750倍液防治假眼小绿叶蝉，效果达50．4%;韦静峰等［20］应用0．2%苦皮藤素乳油500倍液防治假眼小绿叶蝉，8 d防治效果可达76．4%;濮小英等［18］和冯明光等［21］的研究证明病原微生物与其它生物农药混配，有效地提高了白僵菌对寄主昆虫的致病力。白僵菌BLK菌株的生物学特性，及其与其它生物农药的相容性和增效性的研究结果将另文报道。

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