天花粉蛋白基因导入大豆的研究

邹 莉，任清政，孙婷婷，文 艺，张匀华

(1．东北林业大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2．西藏出入境检验检疫局，西藏 拉萨 850000;3．黑龙江省农业科学院植物保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)

大豆［Glycinemax(L．)Merrill］是重要的粮食、油料和饲料作物，是植物蛋白的主要来源，在国内外市场上占有十分重要的地位。但是大豆生育期病虫害严重，直接威胁着大豆生产［1］。利用基因工程手段，将具有抗病和抗虫特性的基因转入大豆，使大豆免遭病虫危害，在防治大豆病虫害中表现出很好的发展前景。目前，已通过基因工程手段获得抗虫 ，抗病 ，抗除草剂 ，以及品质得到改良的转基因大豆。但是，相对于其它作物如水稻［18-19］、烟草等，大豆属于较难进行遗传转化的物种［20-21］。近年来，大豆遗传转化系统较为常用的是农杆菌介导的子叶节转化系统。李文霞等［22］对农杆菌介导的大豆子叶节转化系统进行了优化。张福丽等［23］在农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化中，通过添加L-半胱氨酸，提高了大豆的转化效率。陈李淼等［24］在子叶节转化系统中，研究了农杆菌浓度与侵染时间的最佳组合配比，乙酰丁香酮的浓度等，为优化大豆子叶节遗传转化系统提供一定的技术支持。

天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是中草药天花粉的有效成分，它对病毒、真菌和昆虫有直接或间接的抑制和杀灭作用［25］。周长梅［26］采用根癌农杆菌介导法首次将TCS基因导入木本植物葡萄中，并获得了PCR阳性植株。刘静等［27］将TCS基因转化泡桐，并证明了转TCS基因泡桐对丛枝病具有一定的抗性。孙婷婷等［28］利用农杆菌介导法将TCS基因成功转入欧美杨108。到目前为止，将天花粉蛋白基因转入大豆中的研究鲜有报道，本试验通过构建具有TCS启动子及结构基因的植物表达载体，并在大肠杆菌中进行表达。采用农杆菌介导法转化大豆，最终获得转基因植株，以期提高其抗病虫性，为今后进行作物抗性分子育种提供优良的候选基因。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌种和质粒 大肠杆菌(E．coli)DH5α，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404，质粒pT1-3、pCambia1381Xa均由北京大学提供。

1．1．2 植物材料 大豆种子合丰35，由黑龙江省农业科学院提供。

1．1．3 试剂与酶 限制性内切酶、回收试剂盒购自Promega公司，T4 DNA连接酶购自华美公司，地高辛探针标记试剂盒购自Roche公司。其它生化试剂购自北京鼎国公司。

1．1．4 培养基 基本培养基为MSB(MS无机成分+B5有机成分)培养基;诱导培养基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA;筛选培养基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg;生根培养基:1/2MSB+1．5 mg/L IBA;抑菌培养基:MSB+1．5 mg/L 6-BA+0．2 mg/LIBA+500 mg/L Cefo;伸长培养基:MSB+0．75 mg/L 6-BA+0．2 mg/L IBA+500 mg/L Cefo+4 mg/L Hyg。

1．1．5 引物 根据TCS的结构基因设计引物，由“PRIMER5”引物设计软件设计，由上海生工公司合成。所设计的引物如下:上游序列(5′-3′):GGGAAGCTTTGCCATATTGTTTCGATTC;下游序列(5′-3′):GGGCATATGGATGTTAGCTTCCGGTTA。

1．2 植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS的构建

用限制性内切酶Sma I和Bgl II酶切质粒pCambia1381Xa，电泳后回收酶切产物，得到载体;用限制性内切酶Sac I酶切质粒pT1-3后补平，再用限制性内切酶Bgl II酶切，得到TCS启动子及结构基因，用T4 DNA连接酶连接到pCambia1381Xa的Sma I和Bgl II位点之间，16℃连接16 h以上，转化E．coli DH5α感受态细胞。提取质粒并进行Kpn I和Bgl II酶切鉴定，将筛选到的阳性克隆进行测序，测序正确的阳性菌株命名为pC-tPro-TCS-GUS。

1．3 克隆TCS基因在大肠杆菌中的表达

将测序正确的重组质粒转化E．coli DH5α，挑取单菌落接种于LB液体培养基(含50 mg/L卡那霉素)中，37℃振荡培养过夜。次日按1%的比例转接后，37℃振荡培养4 h，至OD600值达到0．5～0．6后，加入IPTG至终浓度为0．1 mmol/L，37℃诱导培养5 h，离心收集菌体，并进行SDS-PAGE鉴定。

1．4 大豆的遗传转化和T1代植株的获得

将构建好的植物表达载体用液氨冻融法导入农杆菌中。以合丰35为材料，参考Olhoft等［29］的方法切取并侵染大豆的子叶节。将大豆子叶节在诱导培养基上预培养1 d，用OD600=0．5的菌液侵染30 min，在诱导培养基(含有AS 100μmol/L)上共培养3 d，用MSB液体培养基冲洗以除去外植体表面残留的菌体，将子叶节接种到含有头孢霉素的抑菌培养基上培养6 d，待不定芽长到0．3～1．0 cm时，转入筛选培养基中进行筛选和继代，待抗性苗长约3～5 mm时，移入生根培养基中生根，共获得T0代转基因大豆19株。将PCR-Southern阳性的大豆植株种植于装有蛭石和土壤混合物的塑料桶中，收获T0代转基因大豆种子。2011年5月将T0代种子播种于试验田中，设未转基因大豆为对照，9月底收获T1代种子，晒干阴凉处贮存。

1．5 转 TCS基因大豆 T0和 T1代分子检测

采用CTAB法提取T0代和T1代大豆叶片总DNA，利用TCS结构基因的特异性引物进行PCR扩增。PCR反应条件为:94℃预变性，4 min;循环参数:94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min，35个循环;72℃延伸，10 min。

从PCR为阳性的植株中选取转化植株进行PCR-Southern杂交分析。将PCR扩增产物进行0．7%琼脂糖凝胶电泳分离。采用高盐印迹法将凝胶上的DNA转移到尼龙膜上，地高辛标记检测试剂盒进行PCR-Souhern杂交。

2 结果与分析

2．1 植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS的鉴定

将构建的植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS转化大肠杆菌DH5α，对Kam平板上长出的菌落用PCR进行阳性克隆的筛选。提取重组质粒DNA，用KpnⅠ/BglⅡ双酶消化重组质粒pC-tPro-TCS-GUS，有一外源片段大小与TCS启动子及结构基因大小相等，约2 000 bp(图1)，证明TCS启动子及结构基因正确地插入到表达载体pCambia1381Xa的SmaⅠ和BglⅡ位点之间，将筛选的阳性克隆测序，结果与文献报道一致。重组植物表达质粒pC-tPro-TCS-GUS构建成功(图2)。

图1 KpnⅠ/BglⅡ双酶切质粒pC-tPro-TCS-GUS电泳图谱Fig．1 Gel electrophoresis of pC-tPro-TCS-GUS plasmid cut by KpnⅠ /BglⅡ

图2 植物表达载体pC-tPro-TCS-GUSFig．2 The plant expression vector pC-tPro-TCS-GUS

图3 目的基因的PCR扩增产物电泳图谱Fig．3 PCR analysis of pC-tPro-TCS-GUS

图4 天花粉蛋白在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE检测Fig．4 SDS-PAGE analysis of TCS expression in E．coli DH5α

2．2 农杆菌工程菌的获得

将植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS转化农杆菌LBA4404，提取质粒进行PCR扩增，扩增出约760 bp大小的目的条带(图3)，与TCS结构基因大小相符。

2．3 克隆TCS基因在大肠杆菌中的表达

将重组质粒转化E．coli DH5α，经0．1mmol/L的IPTG 诱导培养5 h，4℃，6 000 g，离心收集菌体，进行SDS-PAGE鉴定。结果在相对分子质量约30 KD处有1条明显的条带(图4)，与预期的TCS融合蛋白大小一致。结果表明:重组表达质粒pC-tPro-TCS-GUS的TCS基因在大肠杆菌中能够正常表达。

2．4 大豆转化抗性T0代植株的获得

大豆子叶节经农杆菌侵染和共培养后，在含有4 mg/L Hyg的抗性诱导培养基上诱导培养出现抗性不定芽。待抗性不定芽在抗性筛选伸长培养基上长成2～3 cm高的抗性再生苗，将抗性再生苗在不含Hyg的生根培养基上生根，获得再生植株(图5)。本研究转化1 840个外植体，共获得19株抗性再生T0代植株，转化频率为1．033%。

图5 合丰35子叶节经农杆菌介导转化后获得抗性T0代植株转基因植株Fig．5 Production of Hygromycin-resistant T0 plants by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Hefeng 35 Cotyledonary node

2．5 T1代植株的获得

将收获的23粒T0代转基因大豆种子播种于试验田中，共出苗18株T1代植株，转基因植株在大田中生长状况良好，豆粒饱满(图6)。9月底收获T1代种子，晒干阴凉处贮存，用于后代抗病虫性检测。

图 6播种40 d后T1代植株生长状况良好Fig．6 T1 plants grown well after sowing 40 d

2．6 转TCS基因大豆 T0和T1代分子检测

采用CTAB法分别提取T0和T1代抗性植株和未转化植株(阴性对照)叶片的总DNA，以含目的基因的质粒为阳性对照进行PCR扩增。由图7和图8电泳结果可以看出，T0和T1代抗性植株DNA扩增出与质粒DNA产物相同的特异性条带，分子量约为760 bp，而阴性对照株则没有扩增出相应的特异条带。初步证实，目的基因pC-tPro-TCS-GUS已转入到大豆基因组中。

图7 T0代转基因植株PCR检测Fig．7 PCR detection of T0 transgenic plants

图8 T1代转基因植株PCR检测Fig．8 PCR detection of T1 transgenic plants

将PCR检测为阳性的T0代和T1代抗性植株进行PCR-Southern杂交，结果见图9和图10，表明PCR阳性株DNA扩增片段与质粒DNA扩增特异片段有杂交信号、且处于同一位置，而阴性对照植株则没有杂交信号，说明被检测阳性株扩增出的PCR条带确实为特异性的目标带，证明TCS基因已整合到T0代和T1代大豆植株基因组中。

图9 T0代转基因植株的PCR-Southern杂交分析Fig．9 PCR-Southern detection of T0 transgenic plants

图10 T1代转基因植株的PCR-Southern杂交分析Fig．10 PCR-Southern detection of T1 transgenic plants

3 结论与讨论

天花粉蛋白作为中药，在医药领域的应用已经引起广泛重视，近年来研究发现，该蛋白能抑制艾滋病病毒(HIV)在感染的免疫活性细胞内复制繁衍，降低免疫活性细胞中的艾滋病病毒感染的活性细胞数［25］。本研究所构建的植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS带有TCS启动子及结构基因，并且把TCS启动子及结构基因与GUS报告基因的开放阅读框架连接在一起，融和阅读框架的表达产物是一个杂和蛋白，它是否会影响天花粉蛋白的空间结构，改变天花粉蛋白的特性，有待于进一步的研究。

在转化植株鉴定时，对抗性植株进行PCR检测，可初步断定外源基因是否整合到大豆的基因组中，并且此种方法简便、快速，可短时间内对大量抗性植株进行检测。PCR检测可筛选出大量的非转化植株，对已得到的转化植株需进一步用Southern杂交证明其植物体的染色体内是否已整合进目的基因。

通过对TCS基因转移及其在植物中表达的深入研究，可为获得转TCS基因的重要粮食作物和转基因树木提供理论依据;探讨TCS基因对植物病毒、病原真菌和害虫的抑制作用，为利用TCS基因进行植物病虫害防治提供参考依据。

本研究成功构建了植物表达载体pC-tPro-TCS-GUS，并以大豆子叶节为受体材料，采用农杆菌介导法进行了遗传转化，获得了转TCS基因T0代和T1代抗性植株，经PCR、PCR-Southern检测，目的基因已成功导入大豆基因组中，为大豆抗病虫育种提供了基础材料。但目前获得的只是初步的结果，为了获得有应用前景的抗病虫转基因大豆材料，还需尽可能扩大后代群体的规模，从中筛选出TCS基因稳定遗传、抗病虫效果良好的可用于生产实践的转基因大豆新品种。

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