龙葵氯仿提取物对荷瘤鼠肿瘤生长及脾和胸腺指数的影响

郑戴波高聚伟潘 磊陈培丰

·论 著·

龙葵氯仿提取物对荷瘤鼠肿瘤生长及脾和胸腺指数的影响

郑戴波1高聚伟2潘 磊3陈培丰3

目的 观察龙葵氯仿提取物对荷瘤鼠肿瘤生长及脾和胸腺指数的影响。方法 建立Lewis肺癌移植瘤模型，将小鼠随机分为5组，荷瘤模型组予生理盐水（0.2mL/10g）灌胃，龙葵氯仿提取物高、中、低剂量组分别按50、25、12.5mL/kg剂量的龙葵氯仿提取物灌胃，环磷酰胺组予环磷酰胺（CTX）（20mg/kg）腹腔注射（每隔2天1次），共15天。停药后24h，处死小鼠，分别剥离瘤块、胸腺、脾脏组织称重，测定各组小鼠的肿瘤生长抑制率、脾指数和胸腺指数。结果 氯仿高、中、低剂量组抑瘤率分别为25.36%、38.93%、13.57%；CTX组为51.43%。环磷酰胺组及氯仿高、中、低剂量组平均瘤重分别为（1.36±0.07）g、（2.09±0.16）g、（1.71±0.11）g和（2.42±0.07）g，与荷瘤模型组（2.80± 0.04）g比较，差异有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）。与荷瘤模型组比较，氯仿中剂量组的胸腺指数和脾指数显著提高（分别为130.85%、131.04%），差异有统计学意义（P＜0.01），CTX组则显著降低（分别为46.24%和74.69%），差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 龙葵氯仿提取物具有抑制荷瘤小鼠移植瘤生长的作用，其机制可能为通过增加荷瘤小鼠的胸腺和脾脏的重量，抑制荷瘤小鼠胸腺和脾脏萎缩，增加小鼠抗肿瘤免疫反应。

小鼠；Lewis肺癌移植瘤；龙葵氯仿提取物；抑瘤；免疫反应

为研究龙葵的抗癌作用机制，本实验通过建立Lewis肺癌移植瘤模型，观察龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠的肿瘤生长、脾和胸腺指数的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 药 物 龙葵购自浙江中医药大学附属第一医院中药房，产自浙江临安，经该院徐锡山主任药师鉴定为茄科（Solanaceae）茄属（Solanum）植物龙葵（Solanum nigrum L.）的干燥全草。参考文献[1-2]方法，称取干燥的龙葵饮片5kg，用8倍量的氯仿80℃提取2h，提取液除菌，100℃水浴箱浓缩得浸膏，即为龙葵氯仿提取物，置4℃冰箱保存备用。注射用环磷酰胺（CTX）（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号1033021）；生理盐水（NS）（杭州民生药业有限公司，批号312020910）。

1.2 实验动物及瘤株 近交系C57BL/6J纯系小鼠（上海斯莱克动物有限责任公司），许可证号：SCXK（沪）2013-0003。在浙江中医药大学实验动物中心SPF级动物房适应性饲养7天。Lewis肺癌细胞株，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.3 方 法

1.3.1 建立荷瘤模型[1]将接种Lewis肺癌14天的C57BL/6J荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌冰浴条件下剥离瘤组织，选取生长良好的肿块，去除坏死组织，按肿瘤（g）∶生理盐水（mL）为1∶3比例用组织匀浆器制备瘤细胞悬液，200目网筛过滤，1500r/min，5min，用PBS调节细胞浓度约4×106/mL，作为制备小鼠Lewis肺癌模型的细胞悬液。建模前小鼠禁食不禁水12h。无菌条件下，75%酒精消毒小鼠右腋下皮肤3遍，用1mL无菌注射器取细胞悬液0.2mL（含8×105个活细胞），无菌条件下接种于小鼠右腋窝皮下，拔出针头，用酒精棉球轻压针眼处片刻，防止细胞悬液流出。将接种瘤细胞后的小鼠送同一饲养室继续饲养。

1.3.2 分组、灌胃及取标本 接种24h后，将荷瘤小鼠随机分为荷瘤模型组、环磷酰胺组及龙葵氯仿提取物高、中、低剂量（50、25、12.5mg/kg）组，每组8只。

给药剂量参照人鼠给药剂量换算公式方法[2]计算：dB=dA×RB/RA×（WA/WB）1/3，式中：dB、dA是AB两种动物的每kg体质量剂量（mg/kg）；RB、RA是动物体型系数，小鼠为59，人为100；WA、WB是动物的体质量（kg）值。分组后开始给药，1天1次，连续15天。具体用药剂量分别为：荷瘤模型组予生理盐水0.2mL/10g灌胃；高、中、低剂量组分别予50、25、12.5mg/kg龙葵氯仿提取物灌胃；环磷酰胺组于接种后每3天1次按20mg/kg腹腔注射环磷酰胺，每次0.2mL，共5次。停药1天后，称取小鼠体质量并处死，剥离瘤块、胸腺及脾脏，分别称重。

1.4 观察指标 按瘤重计算肿瘤抑制率：肿瘤抑制率（%）=[（对照组平均瘤重g-给药组平均瘤重g）/对照组平均瘤重g]×100%。依据下列公式计算小鼠胸腺、脾指数：胸（脾）腺指数（mg/10g）=[胸（脾）腺重量（mg）/去瘤体质量（g）]×10

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件，计量资料均以（±s） 描述，两组间比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对荷瘤小鼠肿瘤重量及抑瘤率的影响 荷瘤模型组小鼠平均瘤重（2.80±0.04）g，龙葵氯仿提取物各组小鼠平均瘤重均有不同程度降低，其中中剂量组抑瘤率最大，达38.93%，与荷瘤模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响（±s）

表1 龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠肿瘤重量的影响（±s）

注：与荷瘤模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

荷瘤模型组环磷酰胺组氯仿高剂量组氯仿中剂量组氯仿低剂量组88888 -20 50 25 12.5 88888 78888 2.80±0.04 1.36±0.07** 2.09±0.16** 1.71±0.11** 2.42±0.07* 0 51.43 25.36 38.93 13.57

2.2 对荷瘤小鼠胸腺和脾指数的影响 荷瘤模型组小鼠的胸腺指数、脾指数分别为（13.58±1.95）、（147.40± 13.90）mg/10g。龙葵氯仿提取物中、低剂量组胸腺指数、脾指数均较模型组有提高，以中剂量组提高最明显，胸腺指数、脾指数增长率分别达130.85%、131.04%，与荷瘤模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。而氯仿高剂量组和氯仿低剂量组则无明显差异，环磷酰胺组较荷瘤模型组降低（P＜0.01）。氯仿提取物各剂量组与环磷酰胺组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠胸腺指数及脾指数的影响（±s）

表2 龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠胸腺指数及脾指数的影响（±s）

注：与荷瘤模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与环磷酰胺组比较，△P＜0.05

组别荷瘤模型组环磷酰胺组氯仿高剂量组氯仿中剂量组氯仿低剂量组只数88888剂量（mg/kg）-20 50 25 12.5例数78888胸腺指数（mg/10g）13.58±1.95 6.28±0.74** 10.59±1.78△17.77±0.89*△15.6±1.12△脾指数（mg/10g）147.40±13.90 110.10±8.12* 169.79±8.33△193.16±15.44**△173.98±8.34△胸腺指数增长率（%）0 46.24 77.98 130.85 114.87脾指数增长率（%）0 74.69 115.19 131.04 118.03

3 讨 论

龙葵是茄科（Solanaceae）茄属植物龙葵（Solanum nigrum Linne）的全草。龙葵味苦，性寒、微甘，有小毒，归肺，胃、膀胱经，有清热解毒、活血化瘀、利水消肿、止咳祛痰等功效[3]，主治感冒、牙痛、痢疾、慢性支气管炎等[4]。近年还发现有抑癌作用，对多种恶性肿瘤有抑制作用。吴钜凌等[5]用龙葵葶苈汤内服配合顺铂胸腔内灌注化疗治疗肺癌大量恶性胸腔积液，与对照组（单纯顺铂胸腔内灌注）相比，可显著提高临床疗效，降低化疗不良反应发生率，提高机体的细胞免疫功能。顾锦华等[6]用以龙葵、姜黄为主要成分的复方龙葵胶囊灌胃S180肉瘤小鼠及HepA肝癌小鼠，发现其对S180肉瘤的抑制率和对HepA肝癌小鼠生命延长率均明显优于模型对照组（单纯使用羧甲基纤维素钠）和阳性对照组（单纯使用环磷酰胺），其机制与促进S180肿瘤细胞凋亡，使肿瘤细胞周期阻滞于G0/G1期，减少肿瘤细胞在S期的DNA合成有关。黄东彬等[7]用龙葵合剂联合化疗治疗中晚期大肠癌，患者的免疫功能及生活质量均得到显著提高，毒副作用明显降低，取得良好的临床疗效。

龙葵化学成分复杂，含苷类甾体生物碱、龙葵多糖、矿物质、维生素、色素、氨基酸等[8-9]。丁霞等[10]对龙葵不同部位体外抗肿瘤作用进行研究，发现龙葵水提物和醇提物具有体外抗肿瘤作用，其石油和正丁醇部位是其活性部位。本研究结果显示，经龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠移植瘤的生长有一定抑制作用，其中中剂量组抑瘤率为38.93%（P＜0.01）。

T淋巴细胞在宿主对肿瘤组织的免疫反应中起着关键的作用，而胸腺和脾脏是T淋巴细胞成熟、增殖和分化的主要部位，其脏器指数是衡量机体免疫功能的初步指标[11]。本研究结果表明，龙葵氯仿提取物有一定的提高胸腺和脾脏指数的作用，其中以中剂量组最为明显，胸腺和脾脏指数增长率分别为130.85%和131.04%。其作用机制可能与中剂量组更大程度地激活脾脏边缘区及活化T淋巴细胞，从而引起更为强烈的免疫应答有关。本研究提示龙葵氯仿提取物对荷瘤小鼠的免疫器官有一定的保护作用，有可能通过增加荷瘤小鼠的胸腺和脾脏的重量，抑制了肿瘤侵袭所造成的胸腺和脾脏的萎缩，增加机体抗肿瘤免疫反应，以抑制肿瘤的生长，其机制值得进一步研究。

［1］刘建文.药理实验方法学［M］.北京：化学工业出版社，2003：22-23.

［2］孙敬方.动物实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2001：357.

［3］梅全喜.广东地产药材研究［M］.广州：广东科技出版社，2011：247-249.

［4］卢汝梅，谭新武，周媛媛.龙葵的研究进展［J］.时珍国医国药，2009，20（7）：1820.

［5］吴钜凌，顾亮.龙葵葶苈汤治疗肺癌大量恶性胸腔积液及对患者细胞免疫的影响［J］.中国中医急症，2014，23（2）：242-243.

［6］顾锦华，张伟，李锋，等.复方龙葵胶囊抗肿瘤作用及其对肿瘤细胞周期分布的影响［J］.时珍国医国药，2006，17（12）：2463-2464

［7］黄东彬，管静.龙葵合剂联合化疗对47例大肠癌患者生活质量和免疫功能的影响［J］.亚太传统医药，2012，8（10）：37-38.

［8］肖桂武，沈岚，曾和平.龙葵水溶性多糖成分分析［J］.中药材，1997，22（8）：41-45.

［9］肖桂武，曾和平.龙葵多糖的分离、纯化和鉴定［J］.药物生物技术，1998，5（3）：157-160.

［10］丁霞，高国思，李冠业.龙葵不同提取部位体外抗肿瘤作用的研究［J］.时珍国医国药，2011，22（5）：1244-1246.

［11］Lopez DM，Charyulu V，Adhins B.Influence of breast cancer on thymus function in mice［J］.JMammary Gland Biol Neoplasia，2002，7（2）：191-199.

（收稿：2014-11-05 修回：2015-01-26）

EffectsofChloroformExtractfromSolanumNlgrumL.onTumorGrowth,SpleenIndexandThymusIn-dexofMicewithLewisLungCarcinomaXenografts

ZHENG Daibo1,GAO Juwei2,PAN Lei3,CHEN Peifeng3. 1First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China;2Department of Oncology,Third Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China;3Department of Oncology,First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310006),China

Objective To investigate the effects of chloroform extract from Solanum nlgrum L.on the growth of tumor,spleen index and thymus index of mice.M ethods C57BL/6Jmice were inoculated with Lewis lung carcinoma cells and then were randomly divided into 5 groups:model group,high-,middle-and low-dosage chloroform extract groups,and cyclophosphamide group,with 8 mice in each group.Chloroform extract groups were given 50, 25,12.5ml/kg chloroform extract of Solanum nlgrum L.by gavage,respectively.Cyclophosphamide group was given 20mg/kg of the drug by intraperitoneal injection every 3 days.Model group was given normal saline（0.2mL/10g）by gavage.The process lasted for 15d.After drug withdrawal for 24h,the mice were sacrificed and the tumor mass, thymus and spleen were taken out to be weighted for evaluation of inhibition rate,spleen index and thymus index. Results The inhibition rates were 25.36%,38.93%,13.57%,and 51.43%in high-,middle-,and low-dosage chloroform extract groups and cyclophosphamide group.The average tumor weights of cyclophosphamide group and high-,middle-,and low-dosage chloroform extract groups were 1.36±0.07g,2.09±0.16g,1.71±0.11g,2.42±0.07g, respectively,which significantly differ from that of model group（2.80±0.04;P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with those of model group（13.58±1.95mg/10g and 147.40±13.90mg/10g）,the thymus and spleen indexes of middledosage chloroform extract group increased 130.85%and 131.04%,respectively（P＜0.01）,and those of cyclophosphamide group decreased 46.24%and 74.69%,respectively（P＜0.01）.Conclusion Chloroform extract from Solanumnlgrum L.may inhibit the growth of tumor in mice by enhancing the anti-tumor immune response of body through increasing thymus and spleen weights and suppressing their atrophy caused by tumor.

mice;Lewis lung carcinoma xenografts;chloroform extract from Solanum nlgrum L.;anti-tumor; immune response

浙江省中医药科技计划项目（No.2009CA015）

1浙江中医药大学第一临床医学院（杭州 310053）；2浙江中医药大学附属第三医院肿瘤科（杭州 310007）；3浙江中医药大学附属第一医院肿瘤科（杭州 310006）

陈培丰，Tel：0571-87072196；E-mail：CPF12345@163.com