屋尘螨过敏性哮喘患者白介素－2和白介素－4血清水平及基因多态性

杨淑红 李 玲 王 腾 姚 颐 苏汉文 李 艳

屋尘螨是诱发过敏性哮喘、过敏性鼻炎和湿疹等疾病的重要变应原，其发病机制尚未清楚。研究已经证实上、下呼吸道慢性过敏性炎症表现相似，即均有Th2细胞、肥大／嗜碱性细胞、嗜酸性粒细胞以及免疫球蛋白E（ⅠgE）的参与，包括细胞因子如白介素－2（ⅠL－2）、ⅠL－4、ⅠL－13、活化正常 T细胞表达和分泌的调节物（RANTES）和粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（GM－CSF）、炎性化学介质等。遗传与表观遗传变异之间的串扰在疾病发生和进展中至关重要，单核酸多态性（SNP）在复杂炎症性疾病如哮喘、过敏性鼻炎和湿诊中所涉及的不同基因已获得较多关注［1］。近年研 究［2，3］表 明，ⅠL 基 因 多 态 性 与 哮 喘的发生具有一定相关性，但具体到ⅠL－2和ⅠL－4基因多态性及其血清表达水平与屋尘螨过敏性哮喘的关系尚不清楚。因此，本文检测分析屋尘螨过敏性哮喘患者血清ⅠL－2和ⅠL－4水平及其基因多态性变化，从遗传学角度进一步阐明屋尘螨的致病机制。

1 资料与方法

1.1 病例资料和分组

本院门诊及住院首次诊断为过敏性哮喘患者73例（过敏性哮喘组），过敏原检查提示屋尘螨是主要变应原。均符合中华医学会呼吸病学分会支气管哮喘防治指南［4］的诊断标准。患者年龄4－45岁。排除妊娠及哺乳期妇女、1个月内全身应用糖皮质激素者、上和／或下呼吸道感染患者以及自身免疫性疾病患者。纳入病例按照临床表现进行分期［4］和分组：急性发作期组（n＝25）、慢性持续期组（n＝23）和临床缓解期组（n＝25），另选体检无过敏病史健康人群作为对照组（n＝81）。各组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

1.2 标本采集和处理

抽取研究对象空腹静脉血2－3ml置于促凝管中，分离血清后保存于－70℃冰箱，用于检测血清ⅠL－2、ⅠL－4和 SⅠgE 水平；抽取研究对象静脉血约2ml置于EDTA抗凝管中，保存于－20℃冰箱，用于提取外周血基因组DNA。

表1 各组基线资料

1.3 各组ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平检测

采用ELⅠSA。ⅠL－2和ⅠL－4检测试剂盒购自武汉蓝恒生物有限公司（批号：00641、01012），SⅠgE检测试剂盒购自福州法玛西亚普强生物有限公司（批号：4－29051）。三指标均按照试剂盒说明进行检测与判读结果。

1.4 ⅠL－2和ⅠL－4基因多态性分析

1.4.1 DNA提取：采用全血DNA提取试剂盒（上海莱枫生物科技有限公司）提取外周血DNA，操作过程参照试剂说明书。－20℃保存。

1.4.2 聚合酶链反应（PCR）：根据美国国立生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）网站提供的ⅠL－2和ⅠL－4基因序列，采用 Primer 5.0软件进行ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284单核苷酸引物设计（表2），用于检测ⅠL－2rs6534349SNP 中 的 AA 型、GG 型 和 ⅠL－4 rs2227284SNP中的AA型、CC型。PCR扩增条件为95℃3min预变性；95℃30s，58℃50s，72℃1 min，35个循环；最后72℃10min。PCR扩增产物经1.5%DNA凝胶电泳后，采用凝胶自动成像系统拍照后进行电泳条带定性分析。

1.5 统计学处理

采用 SPSS 17.0统计学软件。ⅠL－2、ⅠL－4 和SigE血清水平用均数±标准差（±s）表示，多组之间均数比较使用单因素方差分析，两两比较采用t检验；ⅠL－2和ⅠL－4基因型分布用百分数表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Pearson相关系数法。P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 IL－2和IL－4基因分型引物及扩增片段大小

2 结 果

2.1 各组血清ⅠL－2、ⅠL－4及SⅠgE水平比较

单因素方差分析显示，急性发作期组、慢性持续期组、临床缓解期组ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。ⅠL－2在急性发作期组、慢性持续期组的血清水平明显高于临床缓解期组和对照组（P＜0.01）；而在急性发作期组与慢性持续期组、临床缓解期组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。ⅠL－4在急性发作期组、慢性持续期组血清水平明显高于临床缓解期组和对照组（P＜0.01），而在急性发作期组与慢性持续期组、临床缓解期组与对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。SⅠgE在急性发作期组、慢性持续期组和临床缓解期组的血清水平均明显高于对照组（P＜0.01），而在急性发作期组、慢性持续期组和临床缓解期组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 各组IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

表3 各组IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与临床缓解期组比较，2）P＜0.01

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2.2 ⅠL－2、ⅠL－4与SⅠgE血清水平的相关性

屋尘螨过敏性哮喘患者随疾病的进展，其血清SlgE水平呈下降趋势，而ⅠL－2呈增高趋势，ⅠL－4呈降低趋势（表3）。相关性分析结果为SⅠgE水平与ⅠL－2水平呈显著负相关（为r＝－0.421，P＜0.01），与ⅠL－4水平呈显著正相关（r＝0.522，P＜0.01）。

2.3 过敏性哮喘组和对照组ⅠL－2rs6534349、ⅠL－4 rs2227284基因型检测结果

2.3.1 ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284基因型判读：在ⅠL－2rs6534349凝胶电泳结果中，如果仅出现AA条带或GG条带，判读为AA型（图1a）或GG型（图1b），如果同时出现AA和GG条带，则判读为AG型（图1c）。在ⅠL－4rs2227284凝胶电泳结果中，如果仅出现AA条带或CC条带，判读为AA型（图1d）或CC型（图1e），如果同时出现 AA和CC条带，则判读为AC型（图1f）。

2.3.2 过敏性哮喘组和对照组基因型分布频率比较：过敏性哮喘组ⅠL－2rs6534349GG型频率与对照组比较明显降低，差异有统计学意义（χ2＝8.17，P＜0.01）；而ⅠL－4rs2227284CC型频率与对照组比较明显升高，差异有统计学意义（χ2＝8.99，P＜0.01）。见表4。

图1 ⅠL－2 rs6534349和ⅠL－4 rs2227284 SNP基因多态性电泳图

表4 过敏性哮喘患者IL－2和IL－4基因型频率比较（n，%）

3 讨 论

哮喘是常见的呼吸系统疾病，其发病率逐年上升。目前普遍认为哮喘以多种炎性细胞增加／异常为特征，由多种炎性细胞（嗜酸性粒细胞、淋巴细胞，肥大细胞等）和气道结构细胞（上皮细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞等）及细胞组分（化学因子、细胞因子等）参与的气道慢性炎症性疾病［5］。哮喘不是一种同质性疾病，但不同的表型由于支气管黏膜肿胀和气管平滑肌收缩产生了相同的症状［6］。在哮喘发作期，细胞因子发生紊乱，主要由于Th0向Th1与Th2细胞分化失调所致。

ⅠL－2由 Th细胞产生，与干扰素－r（ⅠFN－r）共同作用，对ⅠgE的产生及Th2克隆表达起抑制作用。本实验结果显示哮喘急性发作期组、慢性持续期组血清ⅠL－2水平下降，临床缓解期组血清ⅠL－2水平恢复至对照组水平，表明随着哮喘病情的缓解，ⅠL－2水平逐渐恢复正常。屋尘螨为外源性过敏原，引起外源性哮喘。外源性哮喘患者ⅠL－2水平低下的主要原因可能为：哮喘患者存在免疫功能障碍，ⅠL－2分泌不足；哮喘发作期患者可溶性白细胞介素－2受体（SⅠL－2R）增加，消耗ⅠL－2；哮喘发作期患者释放大量组织胺，抑制外周血单个核细胞合成ⅠL－2［7］。另外，本研究中ⅠL－2rs6534349GG型在健康人群和哮喘患者之间的差异具有统计学意义，提示哮喘的发作与宿主ⅠL－2基因多态性有一定关系。

ⅠL－4在 Th1、Th2细胞网络中处于重要地位［8］。ⅠL－4是Th2细胞产生的细胞因子之一，能够促进B细胞的活化和增殖，调节抗体同种型转换效应，ⅠgE水平升高，引起Ⅰ型变态反应。本文结果显示，ⅠL－4在哮喘急性发作期、慢性持续期水平升高，临床缓解期恢复至对照组水平，表明过敏性哮喘患者出现Th1／Th2亚群功能失衡，表现为Th1功能低下，Th2功能亢进［9］。过敏性哮喘患者活动期ⅠL－4水平增加的主要原因可能为：外源性抗原（屋尘螨）进入机体后，使T细胞活化，Th0细胞表达ⅠL－4等细胞因子受体数量增加，引起以Th2为主的炎症反应，ⅠgE水平增高，嗜酸性粒细胞、肥大细胞等聚集、激活，分泌毒性蛋白，加重和诱导哮喘的急性发作，引起临床症状［10］。而且ⅠL－4rs2227284CC型在健康人群和哮喘患者之间的差异具有统计学意义，提示哮喘的发作与宿主ⅠL－4基因多态性也有一定关系。

在Ⅰ型变态反应性疾病中，血清SⅠgE升高与疾病相关性的意义远大于总ⅠgE的变化，因此采用屋尘螨SⅠgE与ⅠL－2及ⅠL－4进行相关性分析优于采用总ⅠgE进行相关性分析。本文结果显示，SⅠgE在过敏性哮喘组患者中均增高，且三组之间差异无统计学意义。说明ⅠgE介导的超敏反应持续参与了哮喘的发生，且与ⅠL－2和ⅠL－4的水平存在相关性。

综上所述，屋尘螨引起的特异性哮喘患者存在Th1／Th2免疫调节失衡，其动态平衡的破坏参与了哮喘的发病。ⅠL2、ⅠL4等细胞因子形成的细胞因子网络在过敏性哮喘的发生、发展及其转归中发挥着极其重要的作用。