Prohibitin2在脊髓损伤过程中的表达变化*

王玲玲，崔志明，徐冠华，保国锋，孙郁雨，张金龙

（南通大学第二附属医院脊柱外科，江苏226001）

Prohibitin2（PHB2）是一种在真核细胞中广泛表达并且在进化过程中高度保守的蛋白，研究显示PHB2参与细胞周期调节、细胞生存、转录调节、细胞凋亡、线粒体形态形成、信号转导等多种过程[1]。目前对PHB2蛋白的研究主要集中在与肿瘤发生发展的关系方面，而它在中枢神经系统损伤及修复过程中是否发挥作用，鲜有报道。本研究通过建立大鼠脊髓损伤模型,检测PHB2蛋白在脊髓损伤过程中表达变化，以探讨其在脊髓损伤过程中的可能作用。

1 材料和方法

1.1 动物模型 56只雌性SD大鼠，体重220～250g，随机分为1个正常对照组和6个实验组，每组各8只。采用10%水合氯醛（200mg/kg）腹腔注射麻醉，暴露T12节段脊髓。实验组按Allen打击法，以一根光滑金属棒（直径4mm，重10g）从距脊髓表面10cm高处自由下落，撞击脊髓致大鼠下肢完全瘫痪，缝合皮肤。术后维持室温20℃～28℃，每天挤压膀胱排尿两次直至恢复自主排尿，饮水、饲料及光照不限。对照组只暴露T12节段脊髓而不致伤脊髓，其余处理与实验组相同。

1.2 主要试剂 兔抗鼠Prohibitin2抗体（Sc-67045，Santa Cruz），DAB 显色剂（北京中山生物技术有限公司）。β-actin单抗、HRP标记的山羊抗兔IgG以及HRP标记的山羊抗小鼠IgG（均Sigma公司）。

1.3 组织固定、取材和切片 伤后6h、1d、3d、5d、7d和14d分别用同样方法将将实验组大鼠麻醉后，生理盐水心内灌流后用4%多聚甲醛灌注，以损伤脊髓节段为中心，取长约10mm标本。对照组均在脊髓暴露24h后经灌注固定，取同样长度脊髓标本。所有取出脊髓组织均用4%多聚甲醛固定4h，之后置于30%蔗糖PBS溶液，待组织下沉后做10μm厚的冰冻切片待用。

1.4 Western blot提取脊髓蛋白质样品，在10%SDS0PAGE凝胶中电泳分离,将蛋白质转移至PVDF膜后置于含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液，37℃条件下封闭2h，加入一抗（兔抗人Prohibitin2抗体或者β-actin单抗），4℃孵育过夜，二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG），37℃作用2h，然后行化学荧光法（ECL）显色并观察。

1.5 免疫组织化学 取受伤后1d、3d和14d三个时间点，损伤脊髓组织头端和尾端2mm处组织进行免疫组织化学染色。将取出的脊髓组织依次放入20%及30%蔗糖溶液内梯度脱水，制成14μm厚的冰冻切片。将切片置于3%甲醇-H2O2溶液，37℃条件下孵育30min，然后用PBS洗3次，置于二抗血清封闭液中室温孵育2h，吸除多余封闭液，滴加一抗后室温孵育1h，接着4℃下过夜，再滴加二抗，37℃下孵育1h后滴加卵白素-生物素-过氧化物酶复合物，继续37℃下孵育40min，DAB显色。最后用苏木素进行复染，脱水、透明、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照。光镜下进行阳性细胞计数，具有强和中等棕褐色着色的细胞记为阳性。

1.6 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析，采用t检验对免疫组化阳性细胞数进行组间差异性比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脊髓损伤后Prohibitin2蛋白表达变化 取对照组和实验组脊髓组织，进行蛋白表达检测。Western blot结果显示，脊髓损伤后，PHB2蛋白表达从6h开始迅速下降，持续至3d，之后逐渐上升，于14d后接近正常水平（图1）。

图1 prohibitin2的表达变化

2.2 免疫组织化学分析 结果显示，PHB2在正常脊髓灰质和白质中均有表达，且分布较为均匀。挫伤后第1d，PHB2阳性细胞数的表达在灰质和白质中的表达均有下降，伤后3d，阳性细胞数在脊髓灰质和白质中的表达均明显下降。挫伤后第14d，阳性细胞数在脊髓灰质和白质中均有明显恢复（图2、3），阳性细胞数伤后1d及3d与对照组相比差异均有统计学意义（P<0.05）。

图2 prohibitin2免疫组化

图3 不同时间阳性细胞计数直方图

3 讨 论

脊髓急性损伤后，损伤区髓鞘和轴突崩解破坏，胶质细胞增生活跃，疤痕增生。随后损伤近段的轴突出芽、延伸，在这个神经纤维再生修复的过程中，会涉及到细胞的再生及再生过程中一些细胞周期蛋白的调节作用[2]。

PHB2是细胞的一种多功能蛋白质，是在真核细胞中广泛表达并且在进化过程中高度保守的蛋白，参与细胞的多种生命活动，它最初做为与鼠的B淋巴细胞的IgM受体相互作用蛋白而被Terashima及其同事们发现。研究发现，PHB2蛋白是以复合物的形式定位于线粒体[3]。同时，PHB2被发现可以借助其羧基端的结构域定位在细胞核内，所以PHB2蛋白被认为很有可能是活动于线粒体与细胞核之间的一种蛋白[4-5]。研究显示PHB2参与细胞周期调节、细胞生存、转录调节、细胞凋亡、线粒体形态形成、信号转导等多种过程[6-8]。主要表现在PHB2能抑制细胞增殖，这种作用是细胞周期特异性的，主要在G期-S期之间发挥检查点的作用，抑制核转录因子E2F的转录活性[9]。然而，又有研究表明，PHB2是胚胎发育所必须的。敲除大鼠PHB2导致PHB1和PHB2蛋白同时缺失，会损害大鼠的胚胎成纤维细胞增殖[10]。

本实验结果显示：PHB2在脊髓灰质和白质中均匀分布，在脊髓损伤后后，PHB2的表达先降低，3d后降至最低点，后又逐渐上升，14d时接近于正常水平，而在脊髓白质和灰质中的分布也均体现了相一致的变化，即在急性脊髓损伤后，PHB2的表达出现一定的时空变化特点，从而提示其可能参与了脊髓损伤和修复过程，也就是可能通过调节相应细胞的凋亡和增殖发挥了一定作用。但具体PHB2定位于脊髓组织中何种细胞，通过何种机制发挥作用，这些是需要进一步研究的内容。

[1]Theiss AL，Sitaraman SV.The role and therapeutic potential of prohibitin in disease［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813（6）：1137-1143.

[2]Coates PJ，Nenutil R，McGregor A，et al.Mammalian prohibitin proteins respond tomitochondrial stress and decrease during cellular senescence［J］.Exp Cell Res，2001，265（2）：262-273.

[3]Matsuyama S，Nakano Y，Nakamura M，et al.Cloning and expression analysis of prohibitin mRNA in canine mammary tumors［J］.JVetMed Sci，2015，77（1）：101-104.

[4]Jia L，Yi XF，Zhang ZB，et al.Prohibitin as a novel target protein of luteinizing hormone in ovarian epithelial carcinogenesis［J］.Neoplasma，2011，58（2）：104-109.

[5]Artal-Sanz M，Tavernarakis N.Opposing function of mitochondrial prohibitin in aging［J］.Aging（Albany NY），2010，2（12）：1004-1011.

[6]Sievers C，Billig G，Gottschalk K，et al.Prohibitins are required for cancer cell proliferation and adhesion［J］.PLoS One，2010，5（9）：e12735.

[7]Fu P，Yang Z，Bach LA.Prohibitin-2 binding modulates insulin-like growth factor-binding protein-6 （IGFBP-6)-induced rhabdomyosarcoma cell migration［J］.J Biol Chem，2013，288（41）：29890-29900.

[8]Rossi L，Bonuccelli L，Iacopetti P，et al.Prohibitin 2 regulates cell proliferation and mitochondrial cristaemorphogenesis in planarian stem cells［J］.Stem Cell Rev，2014，10（6）：871-887.

[9]Theiss AL，Vijay-Kumar M，Obertone TS，et al.Prohibitin is a novel regulator of antioxidant response that attenuates colonic inflammation in mice［J］.Gastroenterology，2009，137（1）：199-208.

[10]Kasashima K，Ohta E，Kagawa Y，et al.Mitochondrial functions and estrogen receptor-dependent nuclear translocation of pleiotropic human prohibitin 2［J］.JBiol Chem，2006，281（47）：36401-36410.