耐多药肺结核患者血CD4细胞计数及痰菌分离鉴定和药物敏感性试验分析

胡永芳 张汇征 刘家秀 林一民 谭克辉



·论著·

耐多药肺结核患者血CD4细胞计数及痰菌分离鉴定和药物敏感性试验分析

胡永芳 张汇征 刘家秀 林一民 谭克辉

结核, 肺； CD4淋巴细胞计数； 革兰阴性菌； 微生物敏感性试验

耐多药肺结核(MDR-PTB)是指肺结核患者感染的Mtb经体外证实至少同时对异烟肼和利福平耐药[1]。MDR-PTB日趋增多，已成为肺结核防治的极大障碍，如合并呼吸道感染就更加棘手。各种感染性疾病的转归与细胞免疫功能密切相关，尤其是与T淋巴细胞功能的关系更加密切[2]。笔者回顾分析489例MDR-PTB患者CD4细胞和痰中病原菌及药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果，探讨CD4细胞与MDR-PTB患者呼吸道感染的相关性，为制定治疗方案提供参考，现将结果报道如下。

资料和方法

一、 临床资料

收集重庆市公共卫生医疗救治中心2013年1月至2014年8月住院治疗的489例经痰结核分枝杆菌培养阳性、药敏试验证实为MDR-PTB，伴咳嗽、咯痰加重、出现肺部啰音或啰音增多、或(和)发热，行血常规和影像学检查支持呼吸道感染者，排除重症监护、呼吸机辅助呼吸者，以及血液系统疾病、自身免疫性疾病、HIV抗体阳性等免疫功能低下者，其中男350例，女139例，年龄范围13～85岁，平均年龄(40.04±15.03)岁。

206例患者痰标本镜下检查每低倍视野中白细胞>25个、上皮细胞<10个且白细胞有吞噬病菌或与病菌并存现象、培养出相应菌为病原菌组，其余283例患者则为无病原菌组。

二、方法

1.主要仪器和试剂：CD4细胞检测采用美国BD公司流式细胞仪(FACSCount)、专用试管及配套试剂。微生物分析系统为美国德灵公司产品及配套鉴定及药敏试验板、辅助试剂，有关药敏试验纸片为英国Oxoid公司产品，血平板、嗜血杆菌平板、麦康凯平板和真菌培养平板等均购自重庆庞通公司。

2.标本采集与处理：按CD4细胞检测要求采集患者静脉血2.0 ml，防止凝集及溶血；不能立即检测者可4 ℃保存24 h。在医护人员指导下，患者留取合格痰标本置于无菌容器中并在2 h内送检。

3.方法：CD4细胞检测按照试剂盒说明书，采用流式细胞仪MutiSET软件自动分析计数，计数单位：个/μl，本室参考值为414～1123 个/μl。按照《全国临床检验操作规程》[3]推荐程序进行细菌培养，采用美国德灵微生物分析系统对分离菌株进行鉴定及药敏试验。采用抑制增强纸片法确认超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)菌株，葡萄球菌体外耐甲氧西林的检测用K-B法头孢西丁进行确认。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC10231，均由重庆市临床检验中心提供。

三、 统计学处理

结 果

一、患者外周血CD4细胞检测结果

489例患者CD4细胞总检测结果在30～1894(438±258)个/μl；无病原菌组为86～1894(514±273)个/μl，38.5%(109/283)低于本室参考值下限；病原菌组为30～935(340±194)个/μl，75.7%(156/206)低于本室参考值下限。两组CD4细胞平均数差异有统计学意义(U=8.23，P<0.01)。将CD4细胞每100个/μl作为一个区间，不同CD4细胞区间两组平均年龄和患者分布比较见表1。

二、痰普通病原菌分布

489例患者283例无病原菌，206例培养出病原菌244株，其中革兰阴性杆菌123株、真菌63株、革兰阳性球菌58株，详见表2。大肠埃希菌6株、肺炎克雷伯菌5株、阴沟肠杆菌2株产ESBLs，检出率5.3%(13/244)；金黄色葡萄球菌6株、凝固酶阴性葡萄球20株耐甲氧西林，检出率为10.7%(26/244)。在CD4<400个/μl区间病原菌感染者154例，占病原菌组的74.8%(154/206)，即大多数低于本室参考值下限。单一真菌35例，3例CD4≤200个/μl、12例201个/μl≤CD4≤400个/μl、10例401个/μl≤CD4≤600个/μl、10例CD4>600个/μl。细菌合并真菌28例，其中17例CD4≤200个/μl和7例201个/μl≤CD4≤400个/μl，4例分散在其他区间。

三、主要病原菌对常用抗菌药物药敏试验结果

多数革兰阴性杆菌对碳青霉烯类100.0%敏感, 对阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星敏感率均在50.0%以上，对哌拉西林、头孢噻肟耐药严重；革兰阳性球菌对达托霉素、利奈唑胺、万古霉素均100.0%敏感，对青霉素、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢曲松耐药率均在60.0%以上(表3，4)。

表1 不同CD4细胞区间病原菌组和无病原菌组平均年龄和患者分布比较

表2 244株病原菌分布和构成比

注 其他真菌包括近平滑念珠菌、毛霉菌、隐球菌、烟曲菌

表3 常用抗菌药物对主要革兰阴性杆菌的耐药率(%)

注 括号中分数为“对某一类菌做某一抗生素药敏试验时，耐药菌株数与全部菌株数之比”

表4 常用抗菌药物对主要革兰阳性球菌的耐药率(%)

注 括号中分数为“对某一类菌做某一抗生素药敏试验时，耐药菌株数与全部菌株数之比”

讨 论

结核分枝杆菌引起的免疫反应主要是细胞免疫，以CD4+T淋巴细胞为主，它激活效应细胞，使其他免疫细胞聚集于感染部位以增强宿主免疫反应[4]。相当一部分MDR-TB患者存在细胞免疫功能低下[5]，MDR-PTB患者在抗结核治疗时还大量使用糖皮质激素，免疫功能被进一步抑制。本研究中患者血CD4细胞普遍偏低，病原菌组低于无病原菌组，两组CD4细胞平均数差异有统计学意义(U=8.23，P<0.01)。表1显示病原菌组74.8%(154/206)在CD4<400个/μl以下，除CD4<100个/μl、301个/μl≤CD4<400个/μl区间外两组患者分布差异均有统计学意义(P<0.05)；病原菌组平均年龄明显大于无病原菌组(t=5.70，P<0.01)。细菌、细菌合并真菌感染者所占比率有随CD4细胞减少而增多的趋势，但不同CD4细胞区间表现不完全相同。CD4+T淋巴细胞数量的多少是机体免疫状态的最好体现，机体主要通过CD4+T淋巴细胞介导的细胞免疫激活巨噬细胞,直接或间接增强杀菌效应[6]。病原菌组患者CD4细胞少,难以依靠细胞免疫清除病原菌；呼吸系统疾病大多数患者都与免疫功能降低有关，而且免疫功能降低，又容易发生感染[7]；老年人胸腺退化，淋巴细胞亚群组成及活性等均降低，导致细胞免疫功能下降[8]，易患各种感染性疾病；无病原菌组CD4细胞相对较多，一定程度上可以靠自身细胞免疫清除病原菌，少数未被清除但达不到痰中病原菌判定标准而被视为无病原菌。检测MDR-PTB血CD4细胞，可作为评估患者免疫力状况、预防、治疗、合理有效干预呼吸道感染的参考。

MDR-PTB患者痰结核分枝杆菌培养持续阳性，导致患者呼吸道免疫力低下，容易发生呼吸道感染[9]；患者多合并支气管扩张、肺部多发空洞、肺纤维化、胸膜增厚等诸多肺部病变，需要长时间的治疗，进一步增加了呼吸道感染的可能性[10]。如发生呼吸道感染，病情迅速恶化，采取有效措施积极处理对病情好转意义重大。本研究中痰普通病原菌以革兰阴性杆菌为主(50.4%)，肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼-溶血不动杆菌、大肠埃希菌居前5位，前4位主要存在于呼吸道或为医院感染重要病原菌，大肠埃希菌是肠道正常寄生菌，移居肠道外为机会致病菌。其次为真菌(25.8%)和革兰阳性球菌(23.8%)，真菌感染率明显高于其他相关流行病学调查结果[11]，以白色念珠菌为主；因患者应用抗生素种类多、时间长而致菌群失调使真菌大量繁殖。革兰阳性球菌中表皮葡萄球菌比率高，可能与抗生素使用不规范扰乱自身平衡所致， ESBLs、MRSA、MRCNS等多重耐药菌的产生与长期使用广谱抗生素、滥用抗生素相关，造成临床治疗困难，应引起高度重视。

痰普通细菌药敏试验结果显示：前5种革兰阴性杆菌除铜绿假单胞菌外未发现对碳青霉烯类耐药，表3显示：多数革兰阴性杆菌对哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星较敏感，对哌拉西林、头孢噻肟、头孢曲松耐药严重。肺炎克雷伯菌对其他抗生素耐药率较低；阴沟肠杆菌对妥布霉素、左氧氟沙星等多种抗生素耐药率为45.0%～55.0%，对其他6种抗生素耐药率较低；铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药率为70.6%，对其他抗生素耐药率较低；鲍曼-溶血不动杆菌对本中心常用抗生素耐药率普遍较低；大肠埃希菌对多种抗生素100.0%耐药。阿米卡星也是二线抗结核药物，虽可作为经验治疗首选抗生素，但由于其肾毒性较大，应慎重使用。ESBLs菌株会产生抗生素灭活酶，可裂解头孢菌素类和青霉素类抗生素的β-内酰胺环结构，使其丧失抗菌活性，因此β-内酰胺类抗生素应与相应酶抑制剂联合使用而发挥抗菌作用。美洛培南对革兰阴性杆菌广泛敏感，在所检测抗生素中抗菌活性最强，可作为治疗耐药菌重症感染首选药物。碳青霉烯类常引起肝肾功能损伤、胃肠道反应等多种不良反应，不建议经验性使用。革兰阳性球菌对青霉素、氨苄西林、氨苄西林-舒巴坦、头孢曲松等耐药严重，对复方新诺明、利福平、四环素、庆大霉素敏感率相对较高。未发现对达托霉素、利奈唑胺、万古霉素耐药菌株，万古霉素不良反应多且严重，不推荐首选使用。MRSA、MRCNS具有多耐药和强耐药性，与第3代头孢菌素和碳青霉烯类的滥用有关。菌株的来源、培养条件、使用抗生素等情况不同而耐药性不同；即便菌种相同，但在不同医院或者地区的耐药性也会不同；临床医生应了解流行菌株耐药性，合理使用抗生素。

目前，有关CD4+T淋巴细胞与MDR-PTB患者痰中病原菌相关性研究未见报道，蔡青山、毛良平、宋晓东等[9-10,12]只作了MDR-PTB呼吸道感染痰普通细菌及药敏试验结果分析，且收集的病例资料较少；我们收集了较多病例资料，在CD4+T淋巴细胞与痰中普通病原菌同步检测结果趋势和意义作了研究，为本研究的独到之处。

综上所述，MDR-PTB患者存在以CD4细胞下降为突出表现的细胞免疫受损，易合并呼吸道感染，痰中病原菌菌株多元化, 耐药广泛而复杂，严重困扰着患者的治疗。检测T淋巴细胞亚群评估细胞免疫功能已成为各种感染性疾病诊断及治疗监测的一项重要手段[2]；建议建立CD4淋巴细胞、呼吸道病原菌及药敏试验常规监测,以便为患者制定个性化治疗方案提供参考，使其得到及时有效治疗。此外，本研究为回顾性研究，未对性别、病程、营养状况等因素是否影响研究结果作进一步分析，有待今后继续收集病例作相应的研究。

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(本文编辑：范永德)

CD4 cell count,sputum bacteria isolation identification and its drug sensitivity test of resistance in multi-drug resistant pulmonary tuberculosis patients

HUYong-fang,ZHANGHui-zheng,LIUJia-xiu,LINYi-min,TANKe-hui.

LaboratoryDepartmentofChongqingMunicipalPublicHealthTreatmentCenter，Chongqing400036,China

LINYi-min,Email：lym_001@aliyun.com；TANKe-hui,Email: 403724868@qq.com

Tuberculosis, pulmonary； CD4 lymphocyte count； Gram-negative bacteria； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.007

400036 重庆市公共卫生医疗救治中心检验科(胡永芳、张汇征、刘家秀)；重庆市肿瘤研究所检验科(林一民)；重庆医药高等专科学校(谭克辉)

林一民，Email：lym_001@aliyun.com；谭克辉,Email: 403724868@qq.com

2014-11-11)