流体静压力调控下Rac1信号通路在大鼠BMSCs成软骨响应中的作用

易飞舟，赵 萤，赵寅华，张 旻

(1.解放军第105医院，安徽 合肥 230001;2.军事口腔医学国家重点实验室，陕西省口腔医学重点实验室，第四军医大学口腔医院急诊与综合临床科，陕西 西安 710032)

关节软骨缺损修复是临床医学中的难点，首先软骨组织缺乏血液供应及神经调控，且细胞代谢缓慢，损伤后很难自行修复;其次，修复后的软骨组织结构和功能与正常软骨组织存在差异，极易发生退化，最终影响关节的正常功能。目前采用组织工程软骨成为了修复软骨缺损的新希望。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是从骨髓中分离出的纤维样非造血成体干细胞，具有分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞等潜能［1］;加之其易于分离、无免疫原性及可塑性强等特点，目前已成为软骨组织工程的理想种子细胞［2］。而软骨组织为机体的承重组织，需要具备一定的机械性能以承受外界力学作用。因此，近年来关于力学刺激对组织工程细胞的影响引起了广泛的关注。有研究发现，在不同类型的力学刺激下，BMSCs可表现为成脂、成骨及成软骨等多向分化的潜能，但其机理尚不明确［3-4］。

Rac1为Rho家族小G蛋白的成员，其主要功能为调节细胞骨架装配、细胞内基因转录调控及细胞的增殖与凋亡［5］。Rac1在力学刺激下细胞形成板状伪足的过程中，对细胞骨架的装配有重要的调节作用［6-8］。有研究发现，当激活Rac1的活性时，不仅能使BMSCs中钙粘蛋白的表达升高，同时还会提高SOX9、Aggrecan和Col-ⅡmRNA的转录水平;从而促进细胞的软骨向分化［9］。以上研究结果均表明，Rac1可参与介导力学信号的传递，并同时调节细胞的增殖及骨架装配，进而调控BMSCs向成软骨方向分化。因此，根据前期研究结果推测，Rac1可能参与调控流体静压力诱导的BMSCs增殖、骨架装配及软骨向分化的过程。本实验采用流体静压力作用于体外培养的BMSCs，同时给予Rac1激动剂PDGF和拮抗剂NSC23766作用细胞，观察流体静压力对BMSCs周期、骨架及成软骨分化的影响，并探讨Rac1在其中发挥的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

SD大鼠(第四军医大学实验动物中心);PDGF(PeproTech，美国);NSC23766(Santa Cruz，美国);FITC-鬼笔环肽(Sigma，美国);α-MEM培养基、2.5 g/L 胰蛋白酶、100 U/mL青霉素、100 U/mL 链霉素(Hyclone，美国);胎牛血清(杭州四季青公司);成软骨诱导液(Cyagen Biosciences，美国);流式细胞仪(BD，美国);激光共聚焦显微镜(Leica，德国);Real-time PCR检测仪(BIO-RAD，美国);可控细胞静态液压加载装置(本课题组自制)。

1.2 大鼠BMSCs体外分离培养和鉴定

1.2.1 大鼠BMSCs的分离培养

采用密度梯度离心法分离培养大鼠BMSCs。取3～4周龄SD大鼠，脱颈椎处死后解剖出股骨，并冲洗出骨髓。所取骨髓经200目筛网过滤后，1 000 r/min离心5 min;然后将细胞重悬于α-MEM培养基(含100 mL/L胎牛血清，100 U/mL青、链霉素)中，37℃、50 mL/L CO2条件下进行培养。3～4 d换液，待细胞融合达80%时，胰酶消化，以1∶2的比例传代培养。

1.2.2 大鼠BMSCs表面标志物鉴定

取生长状态良好的P3代BMSCs，制成密度为1×105/mL的细胞悬液后，取100 μL细胞悬液分别加入 FITC 标记的 CD29、CD44、CD34、CD45;37℃孵育20 min后，将细胞重悬于0.5 mL预冷PBS中，流式细胞仪(FCM)进行检测。

1.3 实验分组设计和力学刺激条件

实验设置空白对照组(C)，常规条件下培养;Rac1激动剂组(Rac1+):20 nmol/L PDGF作用细胞 1 h，不加载;Rac1拮抗剂组(Rac1-):100 nmol/L NSC23766作用细胞1 h，不加载;压力组(P):加载90 kPa静压力1 h;Rac1激动剂+压力组(Rac1+/P):20 nmol/L PDGF预处理1 h后，加载90 kPa静压力1 h;Rac1拮抗剂+压力组(Rac1-/P):100 nmol/L NSC23766预处理1 h后，加载90 kPa静压力1 h。

力学刺激采用可控细胞液压加载装置，刺激条件为:90 kPa压强下加载1 h。该压力加载装置的具体特性、操作及压力加载条件的筛选见参考文献［10-12］。

1.4 不同处理对BMSCs细胞周期影响的观察

取生长状态良好的P3代BMSCs，按上述分组进行处理后，胰酶消化并收集各组细胞;调整细胞密度为1×105/mL后，置于预冷的700 mL/L乙醇、4℃下固定24 h。测定前30 min加入PI染液，振荡混匀并避光染色后，用流式细胞仪(FCM)测定各组细胞的周期。

1.5 不同处理对BMSCs细胞骨架影响的观察

取生长状态良好的P3代BMSCs，胰酶消化后用α-MEM培养液重悬，并调整细胞密度为1×104/mL。将细胞悬液接种于含有盖玻片的24孔板中制成细胞爬片后，按上述分组进行处理。分组处理结束后，取各组细胞爬片，分别经40 g/L多聚甲醛液固定、5 μg/mL FITC-鬼笔环肽室温避光染色后，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。

1.6 不同处理对 BMSCs成软骨基因表达影响的观察

取生长状态良好的P3代BMSCs，用α-MEM培养液重悬并调整细胞密度为5×105/mL后，置于无菌离心管中室温下150 r/min离心5 min;然后按上述分组加入相应的培养液，并置于37℃、50 mL/L CO2的条件下进行静置培养。培养24 h后，换用成软骨诱导液(含100 nmoL/L地塞米松、10 ng/mL TGF-β3、50 mg/mL 维生素 C、acid 2-phosphate、100 mg/mL丙酮酸钠、40 mg/mL脯氨酸的高糖DMEM培养基)，并同时加入ITS-plus(含 6.25 mg/mL 牛胰岛素、6.25 mg/mL 转铁蛋白、6.25 mg/mL 亚硒酸、5.33 mg/mL 亚油酸、1.25 mg/mL牛血清白蛋白)继续静置培养以诱导其分化。诱导期间按分组每天加载90 kPa的静压力1 h，并且始终保持相应组培养基中的Rac1激动剂或拮抗剂的浓度。

于诱导4周后取各组细胞，分别在甲苯胺蓝染色后，光学显微镜下观察并拍照。同时采用Real-time PCR检测成骨标志基因表达:取诱导培养4周的各组细胞用Trizol法提取总RNA，紫外分光光度计测定其浓度和纯度后，采用PrimeScript TMRT-PCR Kit试剂盒合成cDNA。然后以cDNA为模板、β-actin为内参，采用MJ Research DNA Engine Opticon TM2荧光定量PCR仪进行实时定量PCR 反应，分别检测 Sox-9、Aggrecan、COL-Ⅱ各基因的表达情况;并根据所检测Ct值，以2-△△ct法计算各组各基因的mRNA表达水平。PCR反应体系、反应条件严格按试剂盒说明;所用引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠BMSCs体外培养及形态观察

原代培养3 d时可见BMSCs集落，细胞为三角形或长梭形，呈辐射状排列(图1a);培养7～9 d时，细胞迅速生长且集落出现融合;培养10～12 d时，细胞融合达80%以上，即可进行传代。传代后的BMSCs呈长梭状且形状均一，当细胞融合达80%以上时，细胞排列紧密并旋涡状(图1b)。

2.2 大鼠BMSCs鉴定结果

流式细胞仪检测结果显示，P3代大鼠BMSCs中有 95.8% 表达 CD29，96.4% 表达 CD44，2.1%表达CD34，2.5%表达CD45(图2)。表明所培养的细胞为间充质来源的干细胞，而非造血干细胞。

2.3 各组大鼠BMSCs的细胞增殖活性比较

细胞增殖活性指标包括DNA合成期细胞比例(S-phase fraction，SPF)及增殖指数(proliferation index，PI)，计算公式为:SPF=S/(G0/1+S+G2/M)×100%;PI=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)×100%。检测结果显示，在Rac1+、P、Rac1+/P组中 DNA合成期的 SPF、PI均显著高于 C组(P＜0.05)，而 Rac1-组则显著低于C组(P＜0.05)，说明 Rac1通路的激活及压力都可促进细胞周期的启动和增殖，若Rac1通路被抑制则可阻碍该过程;与 P组相比，Rac1-/P组中的SPF、PI均显著降低(P ＜0.05)，提示 Rac1 通路抑制可阻断压力引起的细胞DNA合成及细胞增殖(图3)。

图1 BMSCs细胞形态

图2 BMSCs细胞表面标记分子检测

图3 BMSCs细胞增殖活性(*与C组相比P＜0.05;#两组相比P＜0.05)

2.4 各组大鼠BMSCs的细胞骨架检测结果

激光共聚焦显微镜下可见，C组中F-actin呈丝状，并主要沿细胞长轴排列，贯穿整个细胞;Rac1+组中BMSCs后边缘突起，并形成很多板状伪足;对BMSCs加载压力后，除Rac1-/P组外，其他各组的F-actin纤维束均紧密排列并且明显变粗(图4)。

采用Image-pro plus 6.0软件对各组图像的荧光光密度值(Mean Density)分析显示，P、Rac1-、Rac1-/P组中平均光密度值均明显高于C组(P ＜0.05)，而Rac1+、Rac1+/P组的平均光密度值显著低于C组(P＜0.05)(图5)。提示，Rac1通路抑制及流体静压力均可促进BMSCs的细胞骨架装配，而Rac1通路的激活则对细胞骨架的装配有阻碍作用。

图5 各组BMSCs细胞骨架的光密度值

2.5 各组大鼠BMSCs成软骨标志基因表达水平的比较

成软骨诱导4周后，各组BMSCs均形成细胞团块;甲苯胺蓝染色显示，细胞团块可见蓝色异染颗粒(图6)。BMSCs成软骨诱导4周后RT-PCR检测结果显示，Rac1+、P、Rac1+/P组中成软骨标志基因Sox9、Aggrecan、Col-Ⅱ的表达量均高于C组(P＜0.05);与P组相比，Rac1+/P组中各成软骨标志基因的表达量均显著增高(P＜0.05)，而Rac1-/P组中各成软骨标志基因的表达量均显著降低(P＜0.05)(图7)。以上结果提示，Rac1参与流体静压力诱导的BMSCs成软骨向分化的调控，且主要为正向调控。

图6 各组BMSCs成软骨诱导4周后甲苯胺蓝染色观察结果

图7 各组各成软骨标志基因表达水平的比较

3 讨论

力学刺激可促进BMSCs增殖，但其机理尚不明确。有研究发现，细胞的G1期启动主要是由细胞周期依赖激酶(CDK)与cyclinD结合以及cyclin E的激活［13-15］。因此，G1周期的启动主要依赖细胞内cyclin蛋白及CDK抑制剂的浓度。另有研究发现，RAC通路可通过整合蛋白启动cyclinD mRNA 翻译［16］及 cyclinD 前体蛋白的表达［17］。本实验中发现，抑制Rac1的活性后可促使压力引发的细胞周期启动发生停滞，提示压力可能通过整合蛋白-Rac-cyclinD通路控制细胞周期的启动，而抑制Rac1的活性则可影响cyclinD蛋白的表达，并最终促使细胞周期发生停滞。

细胞骨架(cytoskeleton)是细胞中纤维组成的网架结构，可为细胞形态的维持、细胞内物质的运输、细胞的黏着及运动等提供支持［18］。而细胞骨架体系是一种受各种因素调控的动态结构，机械信号传导主要依赖F-actin肌动蛋白骨架［19］。本结果显示，激活Rac1可导致板状伪足的形成［20］，说明细胞板状伪足的形成主要依赖Rac的活化。而抑制Rac1活性后细胞形态发生明显的变化，且其光密度值显著高于对照组，说明抑制Rac的活性有助于压力作用下应力纤维的装配。

流体静压力作为模拟软骨关节腔中受力的一种力学加载方式［21］，对BMSCs向成软骨细胞分化有促进作用［22］，并可提高 BMSCs中 Sox9、Aggrecan及ColⅡmRNA的表达量，甚至在缺乏成软骨分化诱导因子(如TGF-β3)的条件下，仍可促进BMSCs向软骨细胞分化［23］。有研究显示，激活Rac1可促进 N-cadherin表达，最终上调 Sox5、Sox6、Sox9、collagenⅡ、Aggrecan mRNA 的转录水平［9］。本结果显示，流体静压力可促进大鼠BMSCs中各成软骨标志基因的表达量显著升高;当在压力条件下激活Rac1时，这种可促进作用更明显，Rac1+/P组中各成软骨标志基因Sox9、Aggrecan及Col-ⅡmRNA的表达量均显著高于P组;而在加压条件下抑制Rac1的活性时，各成软骨标志基因的表达量均较P组显著降低，该结果提示，在压力促BMSCs成软骨分化的过程中部分依赖于Rac1的活性。

本结果提示，在流体静压力导致的细胞周期启动中需依赖Rac1的活性;Rac1在压力引发的细胞骨架装配过程中主要为负向调控作用，而在流体静压力诱导的BMSCs成软骨分化过程中则发挥正向调控作用。

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