硫化氢保护被ATP损伤的PC12细胞*

马　洁，沈　慧，王　璐，宋景贵，韩亚州，李东亮△(新乡医学院生理学与神经生物学教研室，附属中心医院，第三附属医院，第二附属医院，河南新乡00;沁阳市人民医院神经内科，河南沁阳0)

硫化氢保护被ATP损伤的PC12细胞*

马洁1，2，沈慧1，3，王璐1，宋景贵4，韩亚州5，李东亮1△
(新乡医学院1生理学与神经生物学教研室，2附属中心医院，3第三附属医院，4第二附属医院，河南新乡453003;5沁阳市人民医院神经内科，河南沁阳454550)

［摘要］目的:观察硫化氢的供体硫氢化钠( NaHS)对三磷酸腺苷( ATP)诱导的PC12细胞活力、胞内Ca(2 +)浓度(［Ca(2 +)］i)及膜通透性的变化，探讨硫化氢神经保护作用的嘌呤信号机制。方法:将对数生长期高分化的PC12细胞，随机分为4组，分别为( 1)正常对照组:常规培养，不进行ATP处理; ( 2) ATP组:接种细胞24 h后ATP处理; ( 3) NaHS + ATP组: NaHS预先孵育30 min后再用ATP处理，并且NaHS始终存在于反应体系中; ( 4) KN-62 ( P2X7受体阻断剂) + ATP组: KN-62预先孵育30 min，其余同NaHS + ATP组。MTT检测各组细胞活力，Fura-2/ AM荧光染料检测各组［Ca(2 +)］i，检测荧光染料YO-PRO-1的相对荧光单位以反映膜的通透性。结果: ( 1) 0. 3 mmol/L ATP对细胞活力无影响，但1、3、5、10 mmol/L ATP则呈浓度依赖式明显降低细胞活力，200 μmol/L NaHS干预可明显逆转ATP引起的细胞活力下降( P＜0. 05)，而800 μmol/L NaHS预处理则加剧ATP对PC12细胞的损伤( P＜0. 05)。( 2) ATP处理PC12细胞会引起［Ca(2 +)］i迅速升高并且呈浓度依赖性，NaHS预处理能对抗ATP引起的［Ca(2 +)］i升高( P＜0. 05)。( 3)随着ATP浓度的增加及作用时间的延长，PC12细胞内YO-PRO-1的荧光强度显著增加，NaHS预处理可明显减少细胞对YO-PRO-1的摄取( P＜0. 05)。结论:硫化氢可保护ATP损伤的PC12细胞，可能与其抑制［Ca(2 +)］i升高和YO-PRO-1荧光增强有关。

［关键词］三磷酸腺苷;硫化氢;嘌呤P2X7受体; PC12细胞

近年来三磷酸腺苷( adenosine triphosphate，ATP) -P2X嘌呤信号途径在脑缺血-再灌注损伤中的作用逐渐受到关注，而对P2X7受体亚型的研究则成为焦点。在正常生理状态下，ATP作用于P2X7受体并将其激活，引起Ca2 +和Na+内流，K+外流，细胞去极化。而在脑缺血-再灌注损伤时，损伤的神经元和胶质细胞释放大量的ATP［1］，这些高浓度的ATP持续地刺激P2X7受体，不仅使神经元去极化的内向电流振幅随时间增强［2］，而且可形成大的“膜孔”，900 Da以下的各种物质(如NMDG+、YO-PRO-1和ethidium)都可以自由通过［3］，此后进一步引起活性氧、谷氨酸、ATP等炎性物质的释放及炎性体的生成，导致细胞水肿，空泡形成，甚至凋亡和坏死，造成脑、神经组织的继发性损伤［4］。胞外高浓度的ATP是“死亡因子”的理念已经被研究者普遍认可，近年来的研究报道也相继证实了ATP的损伤作用［5］。

关于硫化氢( hydrogen sulfide，H2S)抗缺血-再灌注损伤的机制目前有几种说法，如激活KATP通道说、抑制兴奋毒说、抗氧化说等。而本实验室前期的研究结果证实了ATP损伤PC12细胞与P2X7受体有关，本文则关注H2S对ATP损伤PC12细胞保护作用机制及其关键分子靶点，试图为H2S的临床应用提供一些实验证据。

材料和方法

1细胞系和主要试剂

PC12细胞购于中国科学院上海生科院细胞资源中心。

MTT、ATP、H2S供体硫氢化钠( sodium hydrosulfide，NaHS)、P2X7受体阻断剂KN-62和DMEM培养基均购自Sigma; Fura-2/AM购自Dojindo; YO-PRO-1 Iodide购自Invitrogen;胎牛血清购自HyClone。

2方法

2.1母液及工作液配制ATP用无菌三蒸水配成500 mmol/L的母液，NaHS用无菌三蒸水配成50 mmol/L的母液。KN-62用无菌DMSO配成1 mmol/ L的母液。上述各母液分装后避光于－20℃保存，在使用前配成适宜浓度的工作液。

2.2细胞培养及实验分组PC12细胞置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中常规培养。实验取对数生长期细胞进行，分为正常对照组( DMEM培养基常规培养)、ATP组(接种细胞24 h后用ATP处理)、NaHS + ATP组( NaHS孵育30 min后再用ATP处理，并且NaHS始终存在于反应体系中)和KN-62 + ATP组( KN-62预先孵育30 min，其余同NaHS + ATP组)。

2.3MTT检测细胞活力对数生长期的细胞消化后，稀释为5×105/L密度的细胞悬液，每孔100 μL接种于96孔板中。按照上述方法分组，每组设5个复孔，药物按预定作用时间处理后，加入以PBS配制的浓度为5 g/L的MTT 10 μL，以上配液及加药过程均需避光操作。37℃培养箱中孵育4 h后取出培养板，吸去孔内培养基，每孔加入DMSO 100 μL，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长为490 nm处测量各孔的吸光度( A)。根据下列公式计算各组细胞活力:活力( %) = ( A处理组－A空白组) /( A对照组－A空白组)×100%，实验重复3次。

2.4细胞内钙离子浓度( intracellular Ca2 +concentration，［Ca2 +］i)的测定取对数期生长的细胞，以2 ×105/L的细胞密度接种于35 mm的培养皿中，24 h后各组细胞按分组的描述进行处理。5 μmol/L的Fura-2/AM孵育30 min后常规洗涤，HBSS孵育30 min，使用具有Ca2 +成像系统的荧光显微镜检测ATP引起的［Ca2 +］i变化，［Ca2 +］i以340 nm荧光强度与380 nm荧光强度( F340/F380)的比值来计算。

2.5YO-PRO-1摄入实验检测膜孔形成细胞膜孔形成时分子量为629 Da的YO-PRO-1可进入细胞与核酸结合发出绿光，因此可根据荧光强度反映膜孔开放的程度。YO-PRO-1与ATP同时加入各组，使YO-PRO-1溶液的终浓度为2 μmol/L。37℃孵育1 h，此后使用多功能酶标仪检测(激发波长485 nm，发射波长516 nm)。YO-PRO-1荧光强度= A实验组/ A对照组×100%。本实验将对照组细胞摄取的荧光强度定为100%。

3统计学处理

数据以均数±标准误( mean±SEM)表示，采用SPSS统计软件进行处理，多组间显著性检验用单因素方差分析( one-way ANOVA)，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1 ATP诱导的PC12细胞活力的变化

以空白对照组细胞活力设为100%，0. 3、1、3、5 和10 mmol/L ATP作用3 h后，PC12细胞活力分别为98. 7%、87. 5%、83. 0%、80. 4%和72. 4%，除0. 3 mmol/L组与对照组无显著差异外，其余各组细胞活力均明显低于空白对照组( P＜0. 05)，且随着ATP浓度增大，PC12细胞活力逐渐下降，见图1。

2 NaHS对ATP诱导的PC12细胞活力的影响

不同浓度NaHS预孵育PC12细胞半小时后再用ATP( 3 mmol/L)处理。以空白对照组细胞活力为100%，ATP ( 3 mmol/L)组为83. 0%，50 μmol/L NaHS组为80. 0%，与ATP组相比无明显差异; 200 μmol/L NaHS组为88. 4%，明显高于ATP组( P＜0. 05) ; 800 μmol/L NaHS组为74. 2%，与ATP组相比反而下降( P＜0. 05)。由此表明浓度为200 μmol/ L的NaHS对ATP损伤的PC12细胞具有保护作用，但浓度为800 μmol/L的NaHS对细胞表现为损伤作用，见图1。

3 ATP处理对PC12细胞［Ca2 +］i的影响

Figure 1.The effects of NaHS on the viability of PC12 cells injured by ATP.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;#P＜0. 05 vs ATP group.图1　NaHS对ATP致伤PC12细胞活力的影响

Figure 2.The effects of different concentrations of ATP on［Ca2 +］iof PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs control group.图2　不同浓度ATP对PC12细胞［Ca2 +］i的影响

如图2所示，加入1 mmol/L ATP后［Ca2 +］i轻微升高，与给药前相比无明显差异，但3 mmol/L ATP组［Ca2 +］i增加50%，显著高于给药前的基础值( P＜0. 01)，5 mmol/L ATP组给药后［Ca2 +］i增加66. 3%，也明显高于给药前( P＜0. 01)。结果提示一定浓度的ATP激活相应的嘌呤受体后，可使［Ca2 +］i明显增加，Ca2 +或许是嘌呤信号分子在细胞内传递的关键分子。

4 KN-62与NaHS抑制ATP介导的［Ca2 +］i增高

分别给予P2X7受体阻断剂KN-62与NaHS处理PC12细胞均未引起［Ca2 +］i增加，表明单独使用KN-62或NaHS并不能改变PC12细胞［Ca2 +］i，即KN-62与NaHS均不能激活P2X7受体。

而P2X7受体阻断剂KN-62预孵育0. 5 h后再加入ATP( 3 mmol/L)，KN-62 + ATP组［Ca2 +］i增幅为14. 5%，明显低于ATP( 3 mmol/L)组的50%增幅( P＜0. 01)，表明ATP介导的［Ca2 +］i增高与P2X7受体的激活有关。NaHS预孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，NaHS + ATP组［Ca2 +］i增幅为21. 3%，也明显低于ATP( 3 mmol/L)组的50% ( P＜0. 01)。表明NaHS有类似于KN-62下调ATP介导的［Ca2 +］i升高的作用。

若将NaHS和ATP同时加入，［Ca2 +］i增幅为42. 6%，与单纯ATP( 3 mmol/L)处理组没有显著差异( P＞0. 05)。而NaHS预孵育0. 5 h后再加入ATP ( 3 mmol/L)，［Ca2 +］i为21. 3%，明显低于ATP( 3 mmol/L)组( P＜0. 01)。表明NaHS存在于反应体系的时间及与ATP加入的先后顺序决定其作用的效果，0. 5 h的预处理能逆转ATP介导的［Ca2 +］i升高，见图3。

Figure 3.Inhibitory effects of KN-62 and NaHS on the increase in［Ca2 +］iinduced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 20.＊＊P＜0. 01 vs ATP group;##P＜0. 01 vs NaHS + ATP group.图3　KN-62与NaHS抑制ATP介导的PC12细胞［Ca2 +］i的升高

5 ATP对PC12细胞膜孔形成的影响

不同浓度的ATP作用于PC12细胞1 h后，细胞对YO-PRO-1的摄取量随ATP浓度的增加而增强，3 mmol/L ATP在分别作用15、30和60 min后，PC12细胞对YO-PRO-1的摄取随时间的延长也明显增强。表明ATP介导的PC12细胞膜孔形成既取决于ATP的浓度，又受到ATP作用时间长短的影响，见图4。

Figure 4.The effect of ATP on the uptake of YO-PRO-1 in PC12 cells.Mean±SEM.n =3.＊＊P＜0. 01 vs 0 mmol/L;##P＜0. 01 vs 15 min.图4　ATP对PC12细胞YO-PRO-1摄入的影响

6 KN-62与NaHS抑制ATP介导的细胞膜孔形成

分别用KN-62和NaHS预孵育0. 5 h再加入ATP( 3 mmol/L)，如图5所示，NaHS + ATP组与KN-62 + ATP组对YO-PRO-1的摄取都明显弱于单纯ATP( 3 mmol/L)组( P＜0. 01)，表明NaHS和KN-62 对ATP介导的细胞膜孔形成都有抑制作用。

Figure 5.The effects of KN-62 and NaHS on YO-PRO-1 uptake induced by ATP in PC12 cells.Mean±SEM.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs control group;##P＜0. 01 vs ATP group.图5　KN-62和NaHS对胞外ATP诱导的PC12细胞摄入YO-PRO-1的影响

讨论

PC12细胞是一种大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，在NGF诱导下其分化、生长、生理功能等方面均类似于神经元。用高浓度ATP处理PC12细胞，则类似于模拟体内各种病理条件如缺血、炎症、休克时损伤神经元、胶质细胞释放的大量ATP对病灶周围正常神经元产生的损伤。本文的实验表明0. 3 mmol/L ATP 对PC12细胞活力无影响，但随ATP浓度的增加，PC12细胞的活力逐渐下降，伤亡的细胞也明显增多，这些结果表明高浓度的ATP的确能造成神经元损伤并死亡。NaHS对ATP致伤PC12细胞的保护作用与其浓度有关，本实验的结果显示200 μmol/L浓度的保护作用较佳，更高浓度800 μmol/L的NaHS却对ATP诱导的PC12细胞起损伤作用。有文献指出过量的H2S是细胞色素氧化酶的强抑制剂，能与线粒体内膜呼吸链中的氧化型细胞色素氧化酶中的Fe3 +结合，抑制电子传递和氧的利用，引起细胞内缺氧，造成细胞内窒息［6］。孟金兰等［7］也证实了在PC12细胞中，50～200 μmol/L NaHS可呈浓度依赖性促进存活素表达，而800 μmol/L NaHS处理后存活素的表达明显低于对照组，与本实验的结果相符合，都表明800 μmol/L NaHS对PC12细胞本身可能有损伤作用。

在真核细胞中，Ca2 +是一个非常重要的第二信使，参与调节细胞的各种生理生化反应过程［8］。在生理情况下，维持细胞内钙稳态对健康细胞的生命活动是非常必要的，胞内Ca2 +的失调必将引起细胞损伤死亡。行妍妍等［9］提出了“钙调整点”的假说，认为细胞内Ca2 +浓度过高或过低都会抑制细胞神经突起的生长，影响突触传递、可塑性及神经元的发育。然而，神经系统功能发生紊乱(如脑缺血、低氧症、低血糖症、癫痫等)时，神经元将受到异常刺激，细胞内外的Ca2 +浓度发生波动［10］。脑卒中发生时，机体内的糖酵解增加，使乳酸和酮体聚积，pH值降低，引起细胞内钙超载，胞浆内游离Ca2 +增多，线粒体膜电位降低，从而诱发神经细胞凋亡或坏死［11］。30年前Chahwala等［12］报道了细胞外的ATP能够引起Ca2 +、Na+内流并使MEL细胞的活力下降。由此可见［Ca2 +］i增加会对细胞造成致命的损伤，维持［Ca2 +］i相对稳定对细胞的正常生存具有深远的意义。

有研究表明体外活化P2X7受体需要细胞外ATP浓度≥1 mmol/L，而活化其它的P2受体需要ATP浓度＜100 μmol/L［13］，在我们实验中1 mmol/L ATP对PC12细胞［Ca2 +］i影响甚小，3、5 mmol/L ATP使［Ca2 +］i显著升高，看来ATP诱导PC12细胞［Ca2 +］i升高可能主要是通过激活细胞上的P2X7受体实现的。为证实这一观点，我们进一步使用P2X7受体特异性的阻断剂KN-62预处理，结果发现能对抗ATP引起的［Ca2 +］i升高，从而也印证了上述观点。NaHS与ATP同时加入培养体系，ATP引起的PC12细胞［Ca2 +］i升高的现象没有被抑制，而NaHS预孵育0. 5 h后再加入ATP，［Ca2 +］i升高却明显被逆转，表明NaHS预孵育可以抑制P2X7受体的激活，为NaHS临床使用的适宜时间提供了实验依据。

通常P2X7受体作为阳离子通道发挥作用，但是经过反复或持续地暴露于高浓度的ATP时，可形成允许900 Da以下分子通透的“膜孔”［1］，膜孔的不断增多导致细胞水肿，空泡形成、最终凋亡坏死。我们以分子量为629 Da的荧光物质YO-PRO-1摄入水平作为膜孔形成的指标，分别以不同浓度的ATP作用于PC12细胞，结果显示随ATP浓度的增高，细胞YO-PRO-1摄入水平也明显增加。随后我们用3 mmol/L ATP分别处理PC12细胞15 min、30 min、60 min，结果显示随ATP作用时间的延长，YO-PRO-1进入细胞也逐渐增多。以ATP作用15 min时PC12细胞内的荧光强度为100. 0%，30 min时荧光强度增至112. 2%，1 h时荧光强度达138. 0%。总之，同一作用时间，提高ATP浓度会加速PC12细胞膜孔的形成;而同一ATP浓度作用，则随作用时间延长，也会促进膜孔的形成［14］。Auger等［15］在胸腺细胞中也证实了ATP持续地作用会促使膜孔形成，然后大分子的YO-PRO-1即进入细胞，而P2X7受体特异性的阻滞剂o-ATP能明显拮抗这一现象。在我们的实验中使用了另一种P2X7受体特异性阻滞剂KN-62，结果发现也能减少ATP引起的细胞对YO-PRO-1的摄取，为P2X7受体在ATP诱导的膜孔形成中的重要作用进一步提供了实验依据。

细胞膜的通透性随着ATP浓度改变发生了质的变化，结果细胞膜上形成了大“膜孔”，大量小于900 Da的有机物质自由进出，细胞内稳态失衡而死亡。H2S抗损伤保护细胞的作用已经在多个组织器官得到了证实［16］，H2S是否可通过调控膜孔的激活来实现抗损伤而保护细胞呢?本实验用NaHS ( 200 μmol/L)预孵育30 min可显著减少ATP诱导的YOPRO-1的摄取，减少PC12细胞对大分子的通透，减轻对PC12细胞的损伤，为NaHS调控膜孔激活观点取得了初步证据。

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Protective effect of hydrogen sulfide on PC12 cells injured by ATP

MA Jie1，2，SHEN Hui1，3，WANG Lu1，SONG Jing-gui4，HAN Ya-zhou5，LI Dong-liang1
(1Department of Physiology and Neurobiology，2Affiliated Central Hospital，3The Third Affiliated Hospital，4The Second Affiliated Hospital，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453003，China;5Department of Neurology，Qinyang People’s Hospital，Qinyang 454550，China.E-mail: xyldl8@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To prove the purinergic signaling mechanism of the neuroprotective action of hydrogen sulfide by observing the effects of sodium hydrosulfide ( NaHS)，a donor of hydrogen sulfide，on the cell viability，intracellular Ca(2 +)concentration(［Ca(2 +)］i) and the change of membrane permeability in the PC12 cells injured by adenosine triphosphate ( ATP).METHODS: PC12 cells in logarithmic growth phase were randomly divided into 4 groups.In control group，the cells were cultured without ATP treatment.In ATP group，the cells were treated with ATP after cultured for 24 h.In NaHS + ATP group，the cells were incubated with NaHS for 30 min before treated with ATP，and NaHS always existed in the reaction system.In KN-62 + ATP group，the cells were pretreated with KN-62 for 30 min，and the other treatments were as the same as those in NaHS + ATP group.The cell viability was assessed by MTT assay.The［Ca(2 +)］iwas detected by Fura-2/AM staining.The membrane permeability was observed by staining with fluorescent dye YO-PRO-1.RESULTS: ATP at concentration of 0.3 mmol/L showed no injury effect on the cells.However，the cell viability was dropped gradually in a dose-dependent manner as the ATP at doses of 1，3，5 and 10 mmol/L.The decline of cell viability by ATP was obviously reversed by 200 μmol/L of NaHS in the PC12 cells ( P＜0. 05)，but exasperated by 800 μmol/L of NaHS ( P＜0. 05).At the same time，ATP evoked the increase in［Ca(2 +)］iin a dose-dependent manner，which was inhibited by NaHS ( P＜0. 05).Furthermore，the YO-PRO-1 uptake induced by ATP in a dose-dependent and time-dependent manner was also reduced by NaHS ( P＜0. 05).CONCLUSION: Hydrogen sulfide has protective effect on the PC12 cells injured by ATP.The mechanism may be related to the reverse of the increased［Ca(2 +)］iand YO-PRO-1 uptake.

［KEY WORDS］Adenosine triphosphate; Hydrogen sulfide; Purinergic P2X7receptor; PC12 cells

通讯作者△Tel: 0373-3029104; E-mail: xyldl8@126.com

*［基金项目］国家自然科学基金资助项目( No.81371346; No.81271376) ;新乡医学院2013年度研究生科研创新支持计划资助项目( No.YJSCX201318Y)

［收稿日期］2014-10-22［修回日期］2015-03-02

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1231-06

［中图分类号］R363

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.014