miR-205通过靶向调控TBX18抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力*

郑国沛，贾小婷，彭　聪，贺智敏(广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，广东广州510095)

miR-205通过靶向调控TBX18抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力*

郑国沛，贾小婷，彭聪，贺智敏△
(广州医科大学附属肿瘤医院肿瘤研究所，广东广州510095)

［摘要］目的:探讨微小RNA-205 ( miR-205)在神经胶质瘤组织中的表达模式及其在胶质瘤细胞侵袭中的作用及可能机制。方法:用real-time PCR检测配对神经胶质瘤组织中miR-205的表达，同时用免疫组化方法检测配对组织中TBX18蛋白的表达量;用脂质体将miR-205模拟物( miR-205 mimics)、miR-205抑制物( miR-205 inhibitor)以及相应对照( control)导入U251胶质瘤细胞后，Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化;生物信息学分析结合萤光素酶报告基因实验观察miR-205对TBX18的靶向调控作用;采用RNA干扰技术下调U251细胞中TBX18的表达，用Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果: miR-205在82. 6%所检测的神经胶质瘤组织中表达下调，而TBX18在神经胶质瘤组织中表达上调，两者表达呈负相关;过表达miR-205使U251细胞的侵袭细胞数下降( P＜0. 01)，抑制miR-205表达后U251侵袭细胞数增加( P＜0. 01) ; miR-205在U251胶质瘤细胞中能直接靶向抑制TBX18的表达，干扰TBX18的表达亦使U251细胞的侵袭细胞数下降( P＜0. 01)。结论: miR-205在神经胶质瘤中表达下调，miR-205可能通过靶向调控TBX18影响胶质瘤细胞的侵袭能力，这将为完善胶质瘤侵袭的分子机制及开发新治疗策略以提高胶质瘤治疗效果提供有力的理论依据。

［关键词］神经胶质瘤;微小RNA-205;肿瘤侵袭; TBX18蛋白

神经胶质瘤是最常见的原发性颅内恶性肿瘤，其发病率高、治愈率低，严重危害人类健。胶质瘤的高侵袭性极大地限制了其综合治疗效果的提高［1］，因此，进一步探讨胶质瘤侵袭的分子机制，寻找相应的治疗靶标具有重要意义。越来越多的研究表明microRNAs在肿瘤发生发展中及治疗转归中的重要作用［2］，其中微小RNA-205 ( microRNA-205，miR-205)在乳腺癌［3］、前列腺癌［4］及肾癌［5］等多种恶性肿瘤中存在异常表达并发挥重要功能，然而miR-205在神经胶质瘤中的作用有待研究。本课题将从组织及细胞水平探讨miR-205神经胶质瘤中的作用及可能机制。

材料和方法

1细胞与试剂

U251人胶质瘤细胞系购于中国科学院细胞库。23例胶质瘤及配对组织miRNAs的cDNA文库由本室保存。DMEM培养基和胎牛血清购于Gibco; miR-205及U6特异性引物、miRNA实时定量PCR试剂、miR-205模拟物( miR-205 mimics)及相应对照( mimics-control)购自QIAGEN; Trizol、逆转录试剂盒、realtime PCR检测试剂及Oligofectamine购自Invitrogen; PCR引物及DNA片段由上海英潍捷基公司合成; Transwell试剂盒购自BD; TBX18 siRNA及相应control、鼠抗人TBX18及β-actin的I抗和羊抗鼠IgGHRP II抗为Santa Cruz产品。

2方法

2.1细胞培养及转染U251细胞在37℃、5% CO2的条件下于含10%胎牛血清的DMEM培养液中常规培养。转染前1天将U251细胞接种于6孔板，当细胞长到50%～70%融合后，更换为无血清DMEM培养基，按照操作说明用Lipofectamine 2000将miR-126 mimics及其相应对照，或TBX18 siRNA及其相应对照转染入U251细胞，转染5 h后，将无血清培养基更换为含10%胎牛血清的常规DMEM培养基，继续培养48 h后，抽提RNA或蛋白以检测相关分子的表达变化，或行Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。

2.2Real-time PCRTrizol一步法提取细胞总RNA，取2 μg总RNA，按照Fermentas Revert Aid逆转录试剂盒操作步骤说明进行逆转录cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增目的基因，用于real-time PCR扩增的内参照基因GAPDH上、下游引物序列分别为5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’和5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’; TBX18上、下游引物序列分别为5’-TTCTGGCGACCATCACTACG-3’和5’-ACGCCATTCCCAGTACCTTG-3’;行miRNA的real-time PCR时以U6为内参照，结果以2－ΔΔCt方法分析数据，计算表达差异，实验重复3次。

2.3Transwell实验将包装有Transwell小室的包装盒从－20℃中取出放置室温复温，取出小室放入24孔板中，分别向小室的上、下室加入0. 5 mL已在细胞培养箱中预暖的培养基后，放置于细胞培养箱中进行水化2 h，水化后，小心吸弃上、下室里的液体。消化细胞制备5×107/L的细胞悬液。吸取0. 5 mL的完全培养基于24孔板内，将水化后的小室小

心转移到含有完全培养基的24孔板内，避免产生气泡。吸取0. 5 mL的细胞悬液于小室内，于细胞培养箱中孵育24 h后，吸弃上、下室里的液体，用棉签小心擦净Transwell膜上室面的细胞，用PBS洗涤3次，将迁移到膜下室面的细胞用冰预冷的甲醇固定30分钟，用1%结晶紫被染色10 min，于流动水中漂洗，直至多余的结晶紫洗干净，晾干后于显微镜下观察并拍照记录结果。

2.4Western blot实验细胞用冰预冷的PBS漂洗3遍，加入含cocktail蛋白酶抑制剂的RAPI蛋白裂解液，置于冰上裂解30 min;吸取裂解混合液，4℃、12 000 r/min离心30 min，取上清即为细胞总蛋白。测定总蛋白浓度后按每孔40 μg进行10% SDSPAGE凝胶电泳分离蛋白，电转移至PVDF膜后以5%脱脂奶粉室温封闭2 h;加入稀释后的TBX18 ( 1∶1 000)和β-actin( 1∶3 000) I抗，4℃孵育过夜，PBST洗涤后加HRP标记的II抗室温孵育1 h，ECL底物显色。

2.5报告基因实验将合成含有Spe I和Hind III酶切位点及miR-205结合位点的TBX18-3’UTR正、反链DNA片段，以及缺失miR-205结合位点的正、反链DNA片段退火形成双链后克隆入pMir-Report报告基因载体，分别获得野生型报告基因载体( pMir-Wt)和突变型报告基因载体( pMir-Mut)，野生型正、反链DNA序列分别为: 5’-ctagtTATAAAATGTACATATAATAGAAAATGAAGGCTCACTGGGTTTTTTGACTTTATa-3’和5’-agcttATAAAGTCAAAAAACCCAGTGAGCCTTCATTTTCTATTATATGTACATTTTATAa-3’;突变型正、反链DNA序列分别为: 5’-ctagtTATAAAATGTACATATAATAGAAA……CTCACTGGGTTTTT -TGACTTTA Ta-3’和5’-agcttATAAAGTC-AAAAAACCCAGTGA……TTTCTATTATATGTAC-ATT-TTATAa-3’。按每孔5 000个把U251细胞接种于96孔板，待细胞贴壁后，将miR-205 mimics和control分别与野生型或突变型报告基因载体及pRL-TK用Lipofectamine 2000共转染U251细胞，转染48 h后，用双萤光素酶报告系统检测试剂盒( Promega)于多功能酶标仪上检测萤光素酶的活性，每组3个复孔，以pRL-TK活性为内对照标化pMir-Report的活性，其中control和野生型报告基因组得到的值设为100，实验重复3次。

2.6免疫组化实验将23例胶质瘤及配对组织石蜡切片放入60℃烘箱中烘烤2～4 h，二甲苯10 min 2次，无水乙醇10 min，95%乙醇10 min，75%乙醇10 min，50%乙醇10 min，ddH2O 10 min。3%的H2O2孵育10 min，ddH2O 3 min 3次，PBS浸泡5 min。将切片浸入0. 01 mol/L枸橼酸缓冲液进行抗原热修复，PBS 5 min 3次。5% BSA室温封闭20 min，孵育TBX18抗体( 1∶150) 4℃过夜。PBS 3 min 3次，滴加生物素标记的II抗，37℃孵育1 h。PBS 3 min 3次。DAB显色，苏木素复染2 min，自来水冲洗。50%乙醇5 min，75%乙醇5 min，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯10 min 2次。树胶封片，显微镜下观察。由2位病理医生独立判断结果。

3统计学处理

采用SPSS 17. 0统计软件进行数据处理，计数资料采用χ2检测，计量数据以均数±标准差( mean± SD)表示，两组独立样本采用t检验，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1 miR-205抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力

为了探讨miR-205是否参与神经胶质瘤的发生发展，检测了23例神经胶质瘤组织及配对正常脑组织的miR-205的表达情况，发现相比于正常配对组织，miR-205在19例神经胶质瘤组织中表达下调2倍以上，即miR-205在82. 6%所检测胶质瘤组织中表达下调( P＜0. 01)。既然miR-205在胶质瘤组织中表达下调，为了观察miR-205在胶质细胞中的作用，通过将miR-205的mimics导入U251胶质瘤细胞，相比于control，mimics转染后miR-205的表达上调了7. 48倍( P＜0. 01)，同时发现miR-205过表达明显抑制了U251细胞的侵袭能力，miR-205过表达使U251细胞的侵袭细胞数下降( P＜0. 01)。转染miR-205 inhibitor至U251胶质瘤细胞，与对照组相比，miR-205的表达量下调72. 35%( P＜0. 01)，Transwell实验显示抑制miR-205表达后U251侵袭细胞数增加( P＜0. 01)，见图1。

Figure 1.Downregulation of miR-205 was observed in the glioma tissues and miR-205 inhibited glioma cell invasion.Mean±SD.n = 3.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs normal;##P＜0. 01 vs mimics-control;△△P＜0. 01 vs inhibitor-control.图1　miR-205在胶质瘤组织中低表达且抑制胶质瘤细胞的侵袭转移能力

2miR-205直接靶向调控TBX18的表达

miRNAs一般通过调控其靶基因的表达来实现生物学功能，通过生物信息学分析发现TBX18 mRNA 3’UTR的116～122位置有一个在物种间保守的miR-205种子区结合位点。在配对胶质瘤组织和正常组织中检测TBX18的表达量，免疫组化实验显示TBX18在胶质瘤组织中的表达量显著高于其在配对正常组织中的表达量。同时发现将miR-205 mimics导入U251细胞后，TBX18的表达在mRNA水平无明显改变，而在蛋白水平明显下调。为了提供miR-205通过其种子区与TBX18的3’UTR互补结合而在转录后调控TBX18表达的直接证据，报告基因实验发现，U251细胞中，相比于对照，miR-205能明显抑制含有野生型结合位点报告基因的活性，使报告基因的活性下降了约63. 6%，而缺失结合位点的突变型则能取消miR-205对报告基因活性的抑制作用，提示TBX18是miR-205的直接调控靶标，见图2。

Figure 2.miR-205 directly targeted TBX18 in the U251 cells.A: schematic of predicted miR-205 binding site in the 3'UTR of human TBX18 mRNA，which was broadly conserved among vertebrates; B: immunohistochemical assay showed that TBX18 was significantly overexpressed in the glioma tissues compared with the normal tissues; C: restoring miR-205 expression with miR-205 mimics repressed TBX18 expression at protein level but not at mRNA level; D: miR-205 suppressed the activity of luciferase linked by the 3'UTR of TBX18.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs normal;##P＜0. 01 vs mimics control;△△P＜0. 01 vs pMir-Wt.图2　miR-205在U251细胞中直接靶向调控TBX18

3下调TBX18表达抑制胶质瘤细胞的侵袭能力

为了观察TBX18是否参与了胶质瘤细胞的侵袭，我们通过siRNA技术下调TBX18的表达，发现3 号siRNA-TBX18( si-3#)能明显下调U251细胞中TBX18的蛋白表达，故在后续实验中将采用si-3#干扰TBX18的表达。干扰TBX18表达后，U251细胞的侵袭能力明显降低，侵袭细胞数下降( P＜0. 01)，见图3。

Figure 3.TBX18 was upregulated in the glioma tissues，and downregulation of TBX18 inhibited U251 glioma cells invasion.Mean± SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs control.图3　TBX18在胶质瘤组织中高表达且下调其表达将抑制U251细胞的侵袭转移能力

讨论

神经胶质瘤作为最常见的颅内恶性肿瘤，其发病率约为5/100 000，胶质瘤呈浸润性生长，在肿瘤周围2 cm以内的正常脑组织中均可能有肿瘤细胞生长，因而恶性脑胶质瘤形成的早期就具有很强的弥散能力，所以即使手术几乎全切强化瘤组织后，仍不能避免其在术腔边缘的复发，手术很难完全切除，化疗和放疗既不能高度特异性地杀伤胶质瘤细胞，治疗效果差，又可能产生中枢神经系统的毒、副作用。所以即便采用综合治疗，其预后仍很差，中位生存期仍极不理想［6］，上述情况在近30年的临床实践中未得到根本改善，因此脑胶质瘤仍是神经外科领域的难治性疾病，阐明其发病机理、寻找新的有效的治疗靶点仍然是神经外科的热点与难点。

miRNA是近年来生命科学界研究的热点，越来越多的证据表明，miRNA作为表观遗传调控的方式之一，很可能在人类肿瘤的发生、发展和预后中起到了重要作用，从而为肿瘤等疾病的基因诊断与治疗提供了新的突破口［2］，尤其是在肿瘤的侵袭转移方面具有非常重要的诊治价值［7］。至于miRNAs在神经胶质瘤中作用，目前亦有所报道，如miR-106b-5p通过靶向调控多个抑癌基因而促进神经胶质瘤的成瘤能力［8］，miR-195靶向抑制cyclin D1和cyclin E1而抑制神经胶质瘤细胞的增殖［9］。本课题研究发现miR-205在神经胶质瘤组织中的表达明显低于配对正常组织，过表达miR-205则能明显抑制胶质瘤细胞的侵袭能力，提示miR-205在神经胶质瘤中可能起着抑癌基因的功能。miR-205基因位于染色体1q32. 2，自从发现与肿瘤的关系以来，由于在特定肿瘤中miR-205能靶向特定的基因表达，既能靶向癌基因，又能靶向抑癌基因，故显示出了抑癌或促癌的双重功能［10］。尽管发现在小鼠乳腺上皮细胞中miR-205靶向抑癌基因PTEN可能促进了肿瘤的起始［11］，然而更多报道指出miR-205在三阴性乳腺癌和转移性乳腺癌细胞或组织中表达明显下调，通过靶向调节HER3、ZEB1及ZEB2等的表达而抑制乳腺癌的增殖和侵袭转移［12］，提示了miR-205在乳腺癌中作用的具有细胞或组织特异性;目前为此，大部分报道miR-205在前列腺癌细胞和组织中表达下调，miR-205能通过维持基底膜和抑制MAPK信号通路而抑制前列腺癌的起始、进展和侵袭转移，并且与预后呈负相关［4］。本课题首次发现了miR-205在神经胶质瘤侵袭中的作用，至于其作用机制，发现miR-205能直接靶向调控TBX18的蛋白表达，干扰下调神经胶质瘤细胞中TBX18的表达亦能明显抑制胶质瘤细胞的侵袭能力，显示出与过表达miR-205相似的效果。

TBX18作为转录因子，目前的研究主要集中于心脏的发育。Wu等［13］的研究报道TBX18在前心外膜细胞中高表达，控制着冠状血管发育的早期步骤，Takeichi等［14］的研究发现TBX18通过上调心外膜细胞中Slug的表达而诱导心外膜细胞的EMT(上皮-间质转化)进程增加细胞迁移能力而进入心脏，在小鼠模型中发现TBX18在成年小鼠心外膜细胞中呈现低表达，而当心脏损伤后，心外膜细胞中TBX18的表达明显上调，动员心外膜细胞分化心肌细胞等参与心脏的损伤修复［15］，这些研究成果验证了TBX18在心脏发育中的重要作用。根据文献报道参与早期发育的细胞进程或基因与肿瘤的发生发展有着密切联系，如EMT进程及其相关调节基因，本课题首次发现了TBX18参与神经胶质瘤细胞的侵袭作用，而至于其具体分子机制，如是否参与调节胶质瘤细胞的EMT进程有待进一步研究。

综上所述，本课题研究发现miR-205在神经胶质瘤组织中表达下调，上调miR-205的表达能明显抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力，在胶质瘤细胞中TBX18是miR-205的直接靶基因且下调TBX18表达亦能明显抑制胶质瘤细胞的侵袭能力。本课题的研究将为完善神经胶质瘤侵袭的分子机制及以miR-205/TBX18轴为靶的分子干预以提高胶质瘤治疗效果的治疗策略开发提供理论依据和基础。

［参考文献］

［1］Onishi M，Ichikawa T，Kurozumi K，et al.Angiogenesis and invasion in glioma［J］.Brain Tumor Pathol，2011，28 ( 1) : 13-24.

［2］Kong YW，Ferland-McCollough D，Jackson TJ，et al.microRNAs in cancer management［J］.Lancet Oncol，2012，13( 6) : e249-e258.

［3］Radojicic J，Zaravinos A，Vrekoussis T，et al.MicroRNA expression analysis in triple-negative ( ER，PR and Her2/ neu) breast cancer［J］.Cell Cycle，2011，10( 3) : 507-517.

［4］Hagman Z，Haflidadóttir BS，Ceder JA，et al.miR-205 negatively regulates the androgen receptor and is associated with adverse outcome of prostate cancer patients［J］.Br J Cancer，2013，108( 8) : 1668-1676.

［5］Gottardo F，Liu CG，Ferracin M，et al.Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers［J］.Urol Oncol， 2007，25( 5) : 387-392.

［6］Hetschko H，Voss V，Horn S，et al.Pharmacological inhibition of Bcl-2 family members reactivates TRAIL-induced apoptosis in malignant glioma［J］.J Neurooncol，2008，86( 3) : 265-272.

［7］Zhang J，Ma L.MicroRNA control of epithelial-mesenchymal transition and metastasis［J］.Cancer Metastasis Rev，2012，31( 3-4) : 653-662.

［8］Liu F，Gong J，Huang W，et al.MicroRNA-106b-5p boosts glioma tumorigensis by targeting multiple tumor suppressor genes［J］.Oncogene，2014，33( 40) : 4813-4822.

［9］Hui W，Yuntao L，Lun L，et al.MicroRNA-195 inhibits the proliferation of human glioma cells by directly targeting cyclin D1 and cyclin E1［J］.PLoS One，2013，8( 1) : e54932.

［10］Wang D，Zhang Z，O’Loughlin E，et al.MicroRNA-205 controls neonatal expansion of skin stem cells by modulating the PI( 3) K pathway［J］.Nat Cell Biol，2013，15 ( 10) : 1153-1163.

［11］Greene SB，Gunaratne PH，Hammond SM，et al.A putative role for microRNA-205 in mammary epithelial cell progenitors［J］.J Cell Sci，2010，123( Pt 4) : 606-618.

［12］Iorio MV，Casalini P，Piovan C，et al.microRNA-205 regulates HER3 in human breast cancer［J］.Cancer Res，2009，69( 6) : 2195-2200.

［13］Wu SP，Dong XR，Regan JN，et al.Tbx18 regulates development of the epicardium and coronary vessels［J］.Dev Biol，2013，383( 2) : 307-320.

［14］Takeichi M，Nimura K，Mori M，et al.The transcription factors Tbx18 and Wt1 control the epicardial epithelialmesenchymal transition through bi-directional regulation of Slug in murine primary epicardial cells［J］.PLoS One，2013，8( 2) : e57829.

［15］Zhou B，Honor LB，He H，et al.Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors［J］.J Clin Invest，2011，121( 5) : 1894-1904.

miR-205 inhibits invasion of glioma cells via targeting TBX18

ZHENG Guo-pei，JIA Xiao-ting，PENG Cong，HE Zhi-min
( Cancer Research Center，Affiliated Tumor Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510095，China.E-mail: hezhimin2005@ yahoo.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the expression pattern of microRNA-205 ( miR-205) in glioma tissues and its role in the invasion of glioma cells.METHODS: The expression of miR-205 and TBX18 was detected by real-time PCR and immunohistochemical observation，respectively.Transwell assay was used to examine the invasion change of U251 glioma cells after miR-205 overexpression via miR-205 mimics or decrease in miR-205 expression by miR-205 inhibitor.The target of miR-205 was searched by bioinformatics analysis combined with experimental analysis.The protein level of TBX18 was determined by Western blotting after siRNA transfection and Transwell assay was conducted.RESULTS: miR-205 expression was downregulated in 82. 6% of detected glioma tissues and TBX18 was significantly overexpressed in glioma tissues compared with normal tissues.miR-205 overexpression remarkably inhibited the invasion potential of U251 glioma cells with a decrease in the invasive cells ( P＜0. 01)，while inhibition of miR-205 significantly enhanced the invasion ability of U251 cells.Mechanically，miR-205 directly targeted TBX18 and downregulation of TBX18 also significantly inhibited the invasion potential of U251 cells with a decrease in the invasive cells ( P＜0. 01).CONCLUSION: miR-205 expression is decreased in glioma，and miR-205 inhibits glioma cell invasion via targeting TBX18.Our research contributes to the mechanisms responsible for glioma invasion and provides theoretical base for developing new therapeutic strategy to treat glioma.

［KEY WORDS］Glioma; MicroRNA-205; Neoplasm invasion; TBX18 protein

通讯作者△Tel: 020-66673666; E-mail: hezhimin2005@ yahoo.com

*［基金项目］2014年广州市属高校科研项目( No.1201430498)

［收稿日期］2015-03-16［修回日期］2015-05-08

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1219-06

［中图分类号］R730. 23

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.012