CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用*

李龙光，李书华，王红艳，龙　捷，谢晓斌，张雅洁(广州医科大学病理学教研室，广东广州510182)

CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对肺癌细胞的靶向杀伤作用*

李龙光，李书华，王红艳，龙捷，谢晓斌，张雅洁△
(广州医科大学病理学教研室，广东广州510182)

［摘要］目的:构建CXCR4启动子的条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP，探究CRAd-CXCR4-GFP对肺癌细胞的靶向杀伤效应。方法: PCR法扩增人CXCR4-E1A基因并克隆至穿梭质粒pDC316-GFP，将骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre和重组质粒pDC316-CXCR4-GFP共转染293细胞，产生重组腺病毒CRAd-CXCR4-GFP并扩增，扩增后进行PCR鉴定和腺病毒滴度测定; real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达，筛选出表达最高的A549细胞;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞，检测两者转染后CXCR4启动子活性和腺病毒复制数;将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞和16HBE细胞，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，CCK-8检测各组细胞活性。结果:成功构建重组质粒pDC316-CXCR4-GFP，与骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre共转染293细胞后第11天可见片状绿色荧光; PCR表明目的基因CXCR4-E1A已成功整合在重组腺病毒基因组中;测定重组腺病毒滴度为1×10(13)PFU/L; CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后E1A的mRNA和E4表达较Ad-NULL组明显上升;与Ad-NULL组和空白对照组相比，CRAd-CXCR4-GFP组前4 d A549细胞凋亡率和活性无明显差异，第5天细胞凋亡率明显增加，细胞活性明显降低，各组间5 d内16HBE细胞的细胞凋亡率和细胞活性均无明显变化。结论:成功构建条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP，该载体对肺癌细胞具有靶向杀伤作用。

［关键词］条件复制型腺病毒;肿瘤特异性启动子; CXCR4启动子

条件复制型腺病毒是一组经过基因改造的腺病毒，它能够选择性地在肿瘤细胞中完成感染和复制周期，从而特异性溶解肿瘤细胞，却不伤及正常细胞。利用肿瘤特异性启动子调控腺病毒复制必需基因E1A是构建条件复制型腺病毒的常用方法，而条件复制型腺病毒在临床应用中仍出现启动子广谱性差的问题［1］。

CXCR4是趋化因子SDF-1的特异性受体，目前已经发现CXCR4在多种组织中表达而在正常组织几乎不表达，与常用的肿瘤特异性启动子survivin、hTERT和COX-2相比，CXCR4启动子在肝脏的活性很低［2］。因此，为进一步增强治疗基因的靶向性，我们利用CXCR4启动子能特异性使腺病毒在肺癌细胞内复制并溶解肺癌细胞的特性，用CXCR4启动子替换控制腺病毒复制必需基因E1A的启动子，构建新的条件复制型腺病毒表达载体CRAd-CXCR4-GFP，并探究该载体对肺癌细胞的靶向杀伤效应。

材料和方法

1材料

293细胞株、A549细胞株、H460细胞株、H520细胞株、H1299细胞株、PAA细胞株、16HBE细胞株及腺病毒载体Ad-NULL均由广州医科大学病理学教研室保存;感受态大肠杆菌DH5α、质粒pMD19-CXCR4-E1A、腺病毒骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre及穿梭质粒pDC316-GFP及腺病毒纯化试剂盒均购自深圳百恩维生物科技有限公司; T4连接酶、限制性内切酶MluⅠ和HindⅢ、PrimeScript RT Reagent Kit、CCK-8试剂盒均购自TaKaRa; Lipofectamine 2000脂质体、质粒小量抽提试剂盒、质粒大量抽提试剂盒和胶回收试剂盒均购自QIAGEN。引物合成及DNA测序由Invitrogen完成。

2方法

2.1重组质粒pDC316-CXCR4-GFP的构建和鉴定

以质粒pMD19-CXCR4-E1A为模板，PCR扩增人CXCR4-E1A序列，在引物中加入MluⅠ和HindⅢ酶切位点。利用Primer 5. 0进行引物设计: CXCR4-E1A上游引物为5’-CGGACGCGTGAAATGCCTCTGGGAGGTCCTGTCC-3’，下游引物为5’-CCCAAGCTT-

TTATGGCCTGGGGCGTTTACAGCTC-3’，产物大小为1 301 bp。反应条件为95℃3 min; 95℃20 s，55℃30 s，72℃45 s，共30个循环;最后72℃5 min。PCR产物进行纯化回收后，与穿梭质粒pDC316-GFP分别进行MluⅠ+ HindⅢ双酶切。酶切片段回收、连接后转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行酶切鉴定，鉴定正确的重组克隆进行测序验证。测序正确的克隆进行大规模质粒提取，用于腺病毒包装实验。

2.2条件复制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP的包装与扩增重组质粒pDC316-CXCR4-GFP、骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre和Lipofectamine 2000脂质体共转染293细胞进行腺病毒包装，同时以质粒pDC316-GFP为阴性对照。每天观察荧光表达和出毒迹象，出毒迹象为细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落，待细胞大部分病变并从培养瓶壁脱落后，进行收毒，为条件复制型腺病毒CRAd-CXCR4-GFP母液，标记为P1。扩增培养293细胞，当细胞汇合度达到80%时，加入CRAd-CXCR4-GFP母液P1，感染60 h后收集细胞。－80℃/37℃反复冻融3次，10 000×g离心10 min收集腺病毒上清。腺病毒扩增至第3代( passage 3，P3)时，用腺病毒纯化试剂盒纯化P3病毒。

2.3CRAd-CXCR4-GFP的鉴定与滴度测定收集P3代病毒，沸水孵育10 min后立即冰浴。短暂离心后取上清用于PCR鉴定模板。特异性引物、扩增体系和条件同材料和方法2，同时用pDC316-CXCR4-GFP作为阳性对照。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。在腺病毒滴度测定前1 d取48孔板，每孔加入3×104个293细胞，用DMEM培养基10倍梯度稀释腺病毒，经48 h感染，利用荧光显微镜计数荧光细胞情况。在最高稀梯度m的孔数出n( n＜10)个带荧光的细胞，则腺病毒滴度为n×10m +3/L( m为稀释梯度)，若n＞10，则需继续稀释。

2.4Real-time PCR检测5种肺癌细胞株CXCR4 mRNA表达用Trizol法提取A549细胞、H460细胞、H520细胞、H1299细胞、PAA细胞和16HBE细胞总RNA，按照RT试剂盒说明书进行逆转录反应。利用Primer 5. 0进行荧光定量引物设计，CXCR4上游引物为5’-CCTGCCTGGTATTGTCATCCTG-3’，下游引物为5’-ACTGTGGTCTTGAGGGCCTTG-3’，产物99 bp; GAPDH为5’-AAATCTGGCACCACACCT-3’，下游引物为5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’，产物145 bp。使用7500荧光定量PCR仪进行扩增反应，按照real-time PCR试剂盒说明书进行定量分析，CXCR4的扩增条件为95℃3 min; 95℃45 s，57℃60 s，72℃30 s，共40个循环;最后72℃5 min; GAPDH的扩增条件同CXCR4。每个样品设3个复孔。以表达倍数=2－ΔΔCt表示基因的表达量，计算表达倍数，实验重复3次。

2.5CXCR4启动子在A549细胞内活性的检测将1. 5×106个A549细胞铺于6孔板，细胞密度长至70%时，分别加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(实验组)和Ad-NULL(空载体组)，同时加入500 μL无血清DMEM培养基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，转染48 h后提取各组细胞RNA。按照试剂盒说明书进行逆转录反应。利用Primer 5. 0进行荧光定量引物设计，E1A上游引物为5’-CCTCCTAGCCATTTTGAACCAC-3’，下游引物为5’-GCACCGCCAACATTACAGAG-3’，产物124 bp。使用7500荧光定量PCR仪进行扩增反应，按照realtime PCR试剂盒说明书进行定量分析，E1A与GAPDH的扩增条件及定量分析同上，每个样品设3个复孔。

2.6重组载体转染A549细胞后腺病毒复制数的检测将1. 5×106个A549细胞铺于6孔板，细胞密度长至70%时，分别加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(实验组)和Ad-NULL(空载体组)，同时加入500 μL无血清DMEM培养基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基;转染48 h后提取各组细胞DNA。利用Primer 5. 0进行荧光定量引物设计，E4上游引物为5’-CAAGCGCAGGTAGATTAAAGTGG-3’，下游引物为5’-GGTTTAGGATGGTGGTGGATG-3’，产物127 bp。使用7500荧光定量PCR仪进行扩增反应，按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行定量分析，E4与GAPDH的扩增条件及定量分析同上。

2.7重组载体体外功能检测将1. 5×106个A549 和16HBE细胞铺于6孔板，细胞密度长至70%时，分别加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(实验组) 和Ad-NULL(空载体组)，并设空白对照组。同时加入500 μL无血清DMEM培养基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基;分别在转染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，使用胰酶消化细胞，离心收集细胞;加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室温避光染色15 min，置流式细胞仪检测，实验重复3次。将1×104个A549和16HBE细胞铺于96孔板，细胞密度长至70%时，分别加入最佳MOI的CRAd-CXCR4-GFP(实验组)和Ad-NULL(空载体组)，并设空白对照组。同时加入500 μL无血清DMEM培养基，2 h后再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基;分别在转染1 d、2 d、3 d、4 d、5 d后，加入10 μL CCK-8溶液，然后置于培养箱孵育1 h;将96孔板置于酶标仪450 nm波长处测定吸光度( A)，实验重复3次。

3统计学处理

所用数据采用SPSS 16. 0软件进行处理，所得数值以均数±标准差( mean±SD)表示，两组间均数比较用t检验进行处理，多组间均数比较用单因素方差分析，以P＜0. 05为差异有统计学意义。

结果

1 重组质粒pDC316-CXCR4-GFP的构建和鉴定

PCR扩增CXCR4-E1A序列，产物纯化后与载体pDC316-GFP进行双酶切、连接和转化，得到数十个克隆。挑取4个克隆，小量摇菌后进行鉴定，结果显示其中1、2和4出现约1 301 bp和5 885 bp两条带，可能为阳性克隆(图1)。经测序鉴定与GenBank提供的序列一致，重组质粒pDC316-CXCR4-GFP构建成功。

Figure 1.The identification of pDC316-CXCR4-GFP by enzymedigestion.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1～4: pDC316-CXCR4-GFP digested by MluⅠand HindⅢ.图1　pDC316-CXCR4-GFP的酶切鉴定结果

2 CRAd-CXCR4-GFP的包装

重组质粒pDC316-CXCR4-GFP和骨架质粒pBHG-lox-E1，3Cre共转染293细胞，并以pDC316-GFP作为阴性对照。24 h后荧光显微镜下观察293细胞发出绿色荧光。因为pDC316-CXCR4-GFP分子量比pDC316-GFP大，所以转染效率较后者低，荧光表达较弱。随着转染细胞的传代，荧光细胞越来越少，但是pDC316-CXCR4-GFP转染293细胞后第11天，荧光细胞呈现片状，说明已包装出P1腺病毒，而pDC316-GFP转染293细胞后则无荧光扩增现象，说明没有包装出腺病毒，见图2。

Figure 2.The package of the first generation of adenovirus after 293 cells transfected with pDC316-CXCR4-GFP (×10).图2　pDC316-CXCR4-GFP从转染后到获得P1腺病毒的绿色荧光图

3 CRAd-CXCR4-GFP的鉴定与滴度测定

从CRAd-CXCR4-GFP的P3样品中可以检测到1 301 bp的条带，表明目的基因已成功整合在重组腺病毒基因组中(图3)。用本文所述方法测得CRAd-CXCR4-GFP滴度为1×1013PFU/L。

4 5种肺癌细胞株CXCR4的表达

结果显示，在5种肺癌细胞株中，A549细胞CXCR4表达最高，见图4。

5 CXCR4启动子在A549细胞内活性

各组转染A549细胞48 h后，实验组的E1A mRNA表达较空载体组明显增强( P＜0. 01)，见图5。

6 CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后的腺病毒复制数

各组转染A549细胞48 h后，实验组的E4 mRNA表达较空载体组明显增强( P＜0. 01)，见图6。

Figure 3.The CRAd-CXCR4-GFP identified by PCR.M: Trans2K PlusⅡDNA marker; Lane 1: pDC316-CXCR4-GFP as the template; Lane 2: CRAd-CXCR4-GFP diluted 10 times as the template.图3　CRAd-CXCR4-GFP P3代病毒的PCR鉴定结果

Figure 4.The expression of CXCR4 mRNA in 6 kinds of lung cancer cell lines detected by real-time PCR.Mean± SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs other cell lines.图4　Real-time PCR检测6种肺癌细胞株CXCR4的mRNA表达

Figure 5.The mRNA expression of E1A detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.图5　Real-time PCR检测E1A的mRNA表达

7 CRAd-CXCR4-GFP的体外功能

流式细胞仪检测显示，各组转染A549细胞后，与空载体组和空白对照组相比，实验组前4 d细胞凋亡率无明显差异，第5天凋亡率明显增加( P＜0. 01)，CCK-8实验亦显示，与空载体组和空白对照组相比，实验组前4 d细胞活性率无明显差异，第5天活性率明显降低( P＜0. 01)，见图7、8。各组间5天内16HBE细胞的凋亡率和细胞活性率均无明显变化，见图9、10。

Figure 6.The mRNA expression of E4 detected by real-timePCR.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL.图6　Real-time PCR检测E4 mRNA的表达

Figure 7.The apoptotic rate of A549 cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.图7　流式细胞术检测转染不同时间A549细胞的凋亡情况

Figure 8.The viability of A549 cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs Ad-NULL and control.图8　CCK-8检测转染后不同时间A549细胞活性的变化

讨论

恶性肿瘤的基因治疗是当今的研究热点。腺病毒载体以其转染效率高，转染细胞类型广泛，不整合到宿主染色体等特点而成为常用的基因载体。目前主要有3种腺病毒系统，包括AdEasy系统、AdMax系统和Adeno-X系统。AdMax包装系统的重组过程发生在293细胞，与其它2种系统相比，避免了在细菌中重组，因此该系统操作简便、重组效率较高和目的基因的表达水平高(系统中的mCMV启动子比CMV启动子强若干倍)［3-4］。我们利用AdMax包装系统成功构建了条件复制型腺病毒载体CRAd-CXCR4-GFP，酶切鉴定和测序鉴定证明了CXCR4-E1A基因成功整合进重组腺病毒基因组，重组质粒在转染293细胞11 d后包装出P1腺病毒并进行病毒的扩增，测定病毒滴度为1×1013PFU/L，可用于后续的体外实验。

Figure 9.The apoptotic rate of 16HBE cells in all groups detected by flow cytometry.Mean±SD.n =3.图9　流式细胞术检测转染后不同时间16HBE细胞的凋亡情况

Figure 10.The viability of 16HBE cells in all groups detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n =3.图10　CCK-8检测转染后不同时间16HBE细胞活性的变化

条件复制型腺病毒的生活周期包括:转染靶细胞→外源基因表达→复制→溶瘤→子代腺病毒释放→重复感染，每个阶段的效率都与其抗癌效应密切相关［5］。CXCR4启动子是腺病毒的复制开关，因此细胞内CXCR4的表达决定了腺病毒的复制能力以及由腺病毒导致的靶向溶瘤作用。本研究中，我们首先利real-time PCR方法从5种肺癌细胞株筛选出CXCR4高表达的A549细胞株，作为靶细胞用于后续研究。

Zhu等［2］构建的CRAd-CXCR4. RGD已在体内外证明了该载体对肺癌较强的靶向性和较低的肝毒性，那我们构建的CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后，CXCR4是否可以启动腺病毒的复制呢?我们将CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL分别转染A549细胞，采用real-time PCR方法检测E1A mRNA的表达情况，可见A549细胞中E1A mRNA呈现高表达，说明CXCR4启动子在A549细胞内具有较高的启动活性。Kim等［6］已证明少量的E1A表达就能满足腺病毒的复制。

腺病毒的复制数决定了条件复制型腺病毒的溶瘤能力，E1A的表达只能反映腺病毒在靶细胞内有无复制，并不能体现腺病毒具体的复制拷贝数。目前多采用检测E4的表达来反映腺病毒具体的复制能力［7］。本研究采用荧光定量PCR检测分别转染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549细胞的E4表达水平，可见在A549细胞中E4呈高表达，表明CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后病毒具有强大的复制能力。

强大的复制能力保证了溶瘤腺病毒功能的实现。我们利用流式细胞仪对分别转染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL后A549细胞和16HBE细胞的凋亡情况进行检测，与空载体组和空白对照组相比，CRAd-CXCR4-GFP组前4 d细胞凋亡率无明显差异，第5天凋亡率明显增加，CCK-8实验亦显示，实验组前4 d细胞活性率无明显差异，第5天活性率明显降低。结果表明CRAd-CXCR4-GFP转染A549细胞后腺病毒在细胞内大量复制，第5天时复制的腺病毒引起了细胞的大量坏死。那本研究构建的溶瘤病毒是否具有肿瘤细胞靶向性?我们采用流式细胞仪与CCK-8-检测方法，同时对分别转染CRAd-CXCR4-GFP和Ad-NULL的永生化支气管上皮细胞16HBE进行检测，结果显示各组间5 d内16HBE细胞的凋亡率和细胞活性率均无明显变化，而相同条件转染的A549细胞可见发生了细胞的大量死亡，说明CXCR4启动子的条件复制型腺病毒能够发挥靶向溶解肺癌细胞的作用。国内外已有大量实验证明CXCR4启动子的肿瘤靶向性。Chu等［8］证明了构建的Ad5/3-CXCR4-E1A能特异性溶解胰腺癌细胞，而对正常胰腺细胞无毒性; Rajendran等［9］指出CXCR4启动子的条件复制型腺病毒对乳腺癌细胞具有靶向杀伤效应;在卵巢癌的研究中亦有相似的报道［10］，由此说明了CXCR4启动子的广谱性，其有望应用于多数肿瘤的临床治疗。

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［9］Rajendran S，O’Hanlon D，Morrissey D，et al.Preclinical evaluation of gene delivery methods for the treatment of loco-regional disease in breast cancer［J］.Exp Biol Med，2011，236( 4) : 423-434.

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Conditionally replicating adenovirus activated by CXCR4 promoter in lung cancer

LI Long-guang，LI Shu-hua，WANG Hong-yan，LONG Jie，XIE Xiao-bin，ZHANG Ya-jie
( Department of Pathology，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China.E-mail: yajie.zhang@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To construct a conditionally replicating adenovirus vector activated by CXCR4 promoter and to evaluate its ability of lysing the lung cancer cells specifically.METHODS: Human CXCR4-E1A gene amplified by PCR was cloned into the shuttle plasmid pDC316-GFP to construct the recombinant shuttle plasmid pDC316-CXCR4-GFP.The recombinat shuttle plasmid and adenovirus genomic plasmid pBHG-lox-E1，3Cre were transfected into 293 cells to construct the recombinant adenovirus CRAd-CXCR4-GFP.PCR was used to detect the target gene fragments，and the viral titer was determined.A549 cells with the highest mRNA expression of CXCR4 were screened out from 5 kinds of lung cancer cell lines by real-time PCR.CXCR4 promoter activity and adenovirus replication numbers were detected in A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL.CRAd-CXCR4-GFP and Ad-NULL were transfected into A549 cells and 16HBE cells，the apoptotic rates were detected by flow cytometry and the viability was analyzed by CCK-8 assay.RESULTS: The recombinant plasmid pDC316-CXCR4-GFP was constructed successfully.Green fluorescence was observed in 293 cells under fluorescent microscope after co-transfection of pDC316-CXCR4-GFP and pBHG-lox-E1，3Cre at 11 d.Green fluorescence was observed in 293 cells after infection of amplified 3rd generational adenovirus.PCR showed that the purpose gene was successfully integrated in recombinant adenovirus genome.The virus in the supernatant reached a titer of 1×10(13)PFU/L.The mRNA expression of E1A and E4 in the A549 cells after transfection of CRAd-CXCR4-GFP was markedly increased compared with Ad-NULL group.Compared with Ad-NULL group and empty control group，the apoptoticbook=1204,ebook=60rate and the viability of A549 cells in CRAd-CXCR4-GFP group had no significant difference in the first 4 d，the apoptotic rate increased significantly at 5 d，and the cell viability declined significantly at 5 d，but the apoptotic rate and the viability of 16HBE cells in each group had no significant difference within 5 days.CONCLUSION: The conditionally replicating adenovirus vector CRAd-CXCR4-GFP has been successfully constructed，which has the ability of lysing lung cancer cells specifically.

［KEY WORDS］Conditionally replicating adenovirus; Tumor-specific promoter; CXCR4 promoter

通讯作者△Tel: 020-81340347; E-mail: yajie.zhang@163.com

*［基金项目］教育部博士点基金博导类课题( No.20134423110001) ;广东省自然科学基金资助项目( No.S2012010010181) ;广州市科技计划( No.2014Y2-00171) ;广州市教育系统创新学术团队项目( No.13C06)

［收稿日期］2014-06-16［修回日期］2015-04-20

［文章编号］1000-4718( 2015)07-1203-06

［中图分类号］R392. 12

［文献标志码］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.009