云南省陆良县蚕区病蚕BmDNV VD1 ORF2 PCR检测及序列分析

张永红 唐芬芬 邵榆岚 朱 峰 白兴荣

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101）

云南省陆良县蚕区病蚕BmDNV VD1 ORF2 PCR检测及序列分析

张永红 唐芬芬 邵榆岚 朱 峰 白兴荣

（云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所，云南蒙自 661101）

根据家蚕浓核病的典型病症，推测云南省陆良县蚕区病蚕感染该病毒；为进一步确认家蚕感染浓核病病毒，参照家蚕浓核病病毒－镇江株（Bombyx mori densonucleosis virus－3，BmDNV－3）基因组VD1链非结构蛋白基因1 ORF2序列设计特异性引物，以病蚕基因组为模板进行PCR扩增来检测该蚕区的病蚕是否感染BmDNV，PCR检测结果得知，在陆良县收集的14户蚕农病蚕样品中有7组样品感染了BmDNV；为进一步了解该地区病毒与已报道病毒株系间的进化关系，纯化该病毒并提取基因组，回收VD1 ORF2上下游引物扩增得到的PCR产物并克隆该基因片段（GenBank登录号：KR909094）；收集NCBI已登录非结构蛋白1基因序列构建系统发生树，从进化树可以得知，BmDNV－3与家蚕浓核病病毒－陆良株（Bombyx mori densonucleosis virus－Luliang，BmDNV－Luliang）聚为1支，说明分离得到的BmDNV为BmDNV－3的1个分离株系，为下一步研究病毒与宿主间基因组进化提供理论依据。

陆良县；家蚕浓核病；PCR；VD1 ORF2；系统发生树；镇江株；陆良株

家蚕浓核病病毒（Bombyx mori densonucleosis virus，BmDNV；Bombyx mori bidensovirus，BmBDV）属于细小病毒科（Parvoviridae）的浓核病毒属（Densovirinae），无囊膜，病毒粒子呈正面体，它主要感染家蚕的中肠柱状上皮细胞［1］。该病毒基因组大小约为4.0～6.5 kb，且为正负链单分子ssDNA，正链和负链包被在不同的衣壳蛋白中，正负链在适当盐浓度条件下抽提可形成双链dsDNA［2］。BmDNV－3病毒基因组含有2种不同的单链线形DNA分子（VD1为6 543 bp，VD2为6 022 bp），两者之间没有同源性，基因组VD1链主要包括4个开放阅读框ORFs（ORF1、ORF2、ORF3、ORF4），VD2包括2个ORFs，VD1和VD2的末端重复序列分别为224 bp和524 bp［3］。VD1与VD2位于2个不同的衣壳蛋白中，VD1与VD2是如何相互作用的还有待于进一步的验证。

家蚕作为重要的经济昆虫，日本株系BmDNV－1［4］、日本山梨株BmDNV－2［5］、镇江株BmDNV－3［3］、印度株BmDNV－4［6］、日本信大株BmDNV－5［7］与重庆株BmDNV－6［8］家蚕浓核病病毒的不同株系在家蚕体内得到分离，上述株系的全基因组序列均被测定，家蚕对不同株系的DNVs的感受性、血清学上存在差异［9］，在宿主感染部位上也存在不同［10］。BmDNV给中国蚕桑产业造成较大的损失，随着检测病毒技术的不断进步，PCR等分子生物学技术被广泛运用；本文以采集于云南省陆良县疑似BmDNV病蚕为样品，根据已报道的BmDNV－3 VD1基因组ORF2序列设计特异引物，通过PCR手段来鉴定是否感染BmDNV，在此基础上，克隆该基因片段、测序，应用生物信息学软件进行分析，构建了DNV进化树，分析了其与已报道株系的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 试验材料及主要试剂

1.1.1 家蚕品种、病毒与细菌 菁松×皓月家蚕品种，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所家蚕资源室提供；BmDNV的病蚕样品，从云南省陆良县14户蚕农家采集，分别编号（1～14号）备用；大肠杆菌DH5α，由云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所实验室保存。

1.1.2 引物 根据GenBank已登陆BmDNV－3株基因组片段VD1 ORF2序列，设计特异性引物（表1），引物由上海生工生物工程公司合成。

表1 BmDNV－3 VD1 ORF2扩增引物序列

1.1.3 试剂 PCR反应体系（10×PCR buffer、dNTPs和Ex－Taq聚合酶）、pMD19－T载体试剂盒，购自大连TaKaRa公司；PCR产物回收试剂盒，购自上海生工生物工程公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病毒粒子收集与基因组提取 准备云南省陆良县14户蚕农的病蚕样品，取出病蚕中肠组织分别用灭菌水研磨后，用纱布过滤匀浆液，于4 000 r／min离心20 min，过滤数次，收集的混合液加到1 mL基因组抽提液（10 mmol／L Tris－Cl，pH8.0；0.1 mol／L EDTA，pH 8.0；0.5%SDS）中，并加入蛋白酶K，55℃水浴2 h；利用Tris平衡酚，酚∶氯仿（1∶1），酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶l），氯仿各抽提1次；无水乙醇沉淀基因组，70%乙醇洗涤DNA，最后用适量的TE溶液溶解沉淀，溶液用于PCR检测。

1.2.2 病毒纯化与基因组提取 根据1.2.1中病蚕样品的PCR检测结果，选取感染BmDNV的1个样品（2号）纯化病毒粒子，接种于菁松×皓月的4龄起蚕，发病后收集病蚕。用1.2.1的方法收集病毒粒子，病毒混合液用氯仿反复抽提，至无明显的白色变性蛋白和脂类，然后用饱和度40%硫酸铵沉淀混合液，用PBS（0.1 M，pH7.2）溶解沉淀；40%（w／w）氯化铯溶液梯度纯化该病毒，45 000 r／min离心30 min，分部收集，取260 nm吸光度部分，4℃保存备用；再次提取病毒基因组用于PCR检测和扩增目的基因片段。

1.2.3 病毒基因组目的片段克隆 纯化后的病毒基因组作为模板进行PCR扩增，反应体系：10×PCR Buffer（Mg2＋）5 μL，2.5 mmol／L dNTPs 4 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，Ex－Taq DNA聚合酶0.25 μL，加ddH2O至50 μL；条件如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃30 s，72℃1 min，35个循环，终止延伸72℃10 min。PCR产物经回收试剂盒纯化，连接到pMD19－T载体并转化大肠杆菌DH5α，M13F／M13R扩增来验证阳性克隆，将阳性菌液送上海生物工程有限公司测序。

1.2.4 目的基因片段生物信息学分析 测序结果用BioXM 2.6软件（http：／／home.njau.edu.cn／～bioxm）进行拼接和分析；应用Prosite数据库（http：／／www.expasy.ch／cgi－bin／prosite／PSScan.cgi）分析该蛋白的结构功能域；已登陆BmDNV VD1 ORF2序列（表2），基于ORF2序列利用MEGA 4构建系统进化树来分析亲缘关系。

表2 浓核病病毒VD1 ORF⁃2序列来源

续表2

2 结果与分析

2.1 采集病蚕样本的PCR检测

从陆良县14户蚕农采集的病蚕样品抽提基因组后，VD1 ORF2上下游引物进行PCR扩增，结果如图1所示，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶检测发现有约975 bp大小的条带，初步确定该地区有7个样品的家蚕感染了BmDNV。

图1 陆良县14个样品的病蚕基因组BmDNV－3 VD1 ORF2 PCR扩增结果

2.2 纯化后病蚕样本的PCR检测

选取陆良县2号病蚕的样本，添食正常家蚕的4龄起蚕，发病后收集病蚕，提取病毒粒子和病毒基因组再次进行PCR扩增确认，从电泳结果得知获得约975 bp大小的条带（图2），克隆该基因片段并测序。

2.3 BmDNV VD1 ORF2基因生物信息学分析

图2 陆良县2号病蚕样本纯化后的基因组BmDNV－3 VD1 ORF2 PCR扩增结果

2.3.1 BmDNV VD1 ORF2编码NS1蛋白生物信息学分析 BmDNV NS1（Non－structural protein 1，非结构蛋白1）为多功能蛋白，在病毒复制过程中具有重要功能［11］。NS1蛋白中也存在细小病毒保守的解旋酶（helicase）／ATP酶基序，涉及病毒DNA复制、序列特异性DNA结合、解旋酶、ATP依赖的专一性核酸内切酶以及ATP酶活性［12－14］。家蚕浓核病病毒－镇江株（Bombyx mori densonucleosis virus－3，BmDNV－3）VD1 ORF2核苷酸序列全长951 bp，编码含316个氨基酸的非结构蛋白NS1；家蚕浓核病病毒－陆良株（Bombyx mori densonucleosis virus－Lu⁃liang，BmDNV－Luliang）VD1 ORF2核苷酸序列全长951 bp，编码也含316个氨基酸。核苷酸序列比对分析发现在C585、C657这2个位置发生了点突变，均为T被替换为C，其中C585为非同义替换，C657为同义替换（图3）；BmDNV－Luliang NS1氨基酸序列中196处由C替换为R（图4），即半胱氨酸变为精氨酸，Prosite数据库分析结果显示（图5）NS1解旋酶为超家族3解旋酶（Superfamily 3 helicase），其催化中心在118－305 aa之间，存在ATP结合位点的A型GXXXXGKT／S（X表示任何氨基酸）保守结构基序，且具有解旋酶活性，NS1蛋白质的解旋酶功能未发生变化。

图3 BmDNV－3与BmDNV－Luliang VD1 ORF－2核苷酸序列比对

图4 BmDNV－3与BmDNV－Luliang NS1氨基酸序列比对

图5 BmDNV⁃Luliang NS1蛋白质功能预测

2.3.2 NS1同源性和系统进化分析 根据已登录的病毒NS1基因序列，利用MEGA 4软件Neighbor Jointing（NJ）法进行系统进化分析（图6），结果显示，BmDNV－3与BmDNV－Luliang聚为1支，两者同其它宿主浓核病亲缘关系都较远，最近的为中国对虾肝胰腺浓核病病毒（Fenneropenaeus chinensis hepa⁃ topancreatic densovirus，FchDNV），分析FchDNV同BmDNV－3、BmDNV－Luliang病毒株系ORF2及NS1同源性，其中FchDNV同BmDNV－3和BmDNV－Lu⁃liang株系，与ORF2核苷酸序列同源性分别为44.2%、44.3%，与NS1氨基酸序列同源性均为18.1%（表3）。

图6 NS1系统进化分析

表3 FchDNV同BmDNV－3、BmDNV－Luliang病毒株系ORF2及NS1同源性比较

3 讨论

PCR检测的14个病蚕样品中有7组样品感染了BmDNV，7个样本是从同一种寄生家蚕品系中获得，而且各农户的地理位置相近，可推测该地区流行的BmDNV株系为同1个株系，所以选取2号样品作为研究的对象，纯化该病毒对正常家蚕进行添食，该病毒同样表现为高致病性，为了分析该病毒株系基因组类型，利用BmDNV－3 VD1 ORF2基因引物扩增得到特异条带，并且该基因的进化树也说明了该病毒为BmDNV－3的1个分离株系。

本研究只对VD1 ORF2序列进行了克隆分析，ORF2与BmDNV－3 ORF2核苷酸序列同源性高达99.8%，其中C585、C6572个位置发生了点突变，均是T被替换为C，其中C585为非同义替换，C657为同义替换，对应的氨基酸序列196处的半胱氨酸变为精氨酸，Prosite数据库预测该蛋白仍然具有解旋酶的功能基序，氨基酸的变化是否直接影响到病毒的毒力，这有待于进一步验证。NS1系统进化分析发现BmDNV－Luliang为BmDNV－3的1个分离株系，该病毒的基因组类型相同，进化树上的其它宿主病毒NS1蛋白都具有解旋酶基序，但同源性都较低，BmDNV－Luliang与FchDNV ORF2核苷酸序列的同源性较高为44.3%，与NS1氨基酸序列的同源性为18.1%（表3），其中2种家蚕的BmDNV与FchDNV亲缘关系较近。

该地区的分离株系VD1和VD2基因组片段还未克隆，其它结构蛋白基因和非结构蛋白基因同BmDNV－3的同源性如何还有待于进一步的研究。

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S881.2

A

1007－0982（2015）04－0038－06

2015－06－02；接受日期：2015－07－31

云南省现代农业蚕桑产业技术体系（编号2013KJTX006）；

现代农业产业技术体系建设专项（编号CARS－22）。

张永红（1985—），男，云南师宗，硕士，研究实习员。

E⁃mail：zhang200503＠126.com

白兴荣，男，副研究员。

Tel：0873－3860077，E⁃mail：bxrong3＠163.com