桑树总黄酮含量变化规律分析

2015-05-16李瑞雪王钰婷胡飞王伟高新文汪泰初

中国蚕业 2015年4期

关键词：蚕业芦丁桑树

李瑞雪王钰婷胡飞王伟高新文汪泰初

（1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2江苏科技大学，江苏镇江 212003；3安徽省农业科学院植保研究所，安徽合肥 230000）

·试验研究·

桑树总黄酮含量变化规律分析

李瑞雪1，2王钰婷1胡飞3王伟1高新文1汪泰初1

（1安徽省农业科学院蚕桑研究所，安徽合肥 230061；2江苏科技大学，江苏镇江 212003；3安徽省农业科学院植保研究所，安徽合肥 230000）

采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法，综合不同桑树品种、桑树不同部位以及不同季节等因素，分析桑树总黄酮含量的变化规律，为富含总黄酮药食用途桑品种育种及其开发利用提供生物资源。结果表明，4个桑属22个桑品种桑叶的总黄酮含量差异极显著（P＜0.01），含量变幅为25.79～63.14 mg／g，湖桑199桑叶总黄酮含量最高，杂选花叶桑叶总黄酮含量最低；皖桑1号等5个桑树品种不同季节桑叶的总黄酮含量以春季最高，夏季最低，差异显著（P＜0.05）；同一季节桑叶的总黄酮含量，远高于枝条、树干基部树皮等部位，差异极显著（P＜0.01）；树干基部树皮总黄酮含量显著高于枝条（P＜0.05）。

桑品种；桑叶；枝条；树干；树皮；比色法；总黄酮；富集规律

我国是世界蚕桑生产的发源地，自然生态环境复杂多样，形成了丰富的桑树品种，有着极大的桑树资源优势。除了桑叶可用于饲喂家蚕，桑皮还可以造纸，桑椹可食用，其叶、枝、果、根皮等均可以入药［1］。现有研究表明，桑树含有种类丰富的化学成分［2－4］，具有降血糖、降血压、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性及药理作用［5－8］，其中黄酮类化合物就是其主要的功能成分之一［9－11］，也是衡量桑、蚕药用价值的重要指标之一，一直是国内外研究的热点。

随着食品化学工业的发展和大众消费观念的转变，由天然活性物质做成的保健食品成为现代人寻求的目标，其中黄酮类化合物以高活性、见效快、绿色天然、作用广泛等特点，日益受到人们的关注。目前研究较多的产黄酮类物质的植物主要有银杏、大豆、茶叶、葛根等植物［12－13］，种类不多，资源较稀少，不能满足市场的需要。而有研究表明，桑树几乎各个部位都含有桑黄酮成分，且含量较高，不同桑品种总黄酮类在桑叶的含量高达44.00～55.38 mg／g［14］。受桑品种、桑树部位、采收季节和发育阶段等因素的影响，总黄酮成分含量存在很大的差异［15－17］，尽管目前有较多关于桑树总黄酮成分含量变化的研究报道，但这些报道仅是考虑单一或部分因素的测定结果，难以真实反映其变化规律，因此有必要综合多种影响因素进行更加全面系统的分析。

本试验挑选了22个典型的桑品种，分别测定了其新梢桑叶中的总黄酮含量，并系统探讨了皖桑1号等6个桑品种不同季节桑叶、皖桑1号等4个桑品种不同部位总黄酮含量的变化规律，以期为深入研究总黄酮在桑树体内的富集和转化规律，更有效地开发利用桑树黄酮类物质资源，更好地开发桑树的药食用价值提供有用的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试桑树样品供试的4个桑属22个桑品种的桑树样品均采自于安徽省桑树品种选育中心10～15年生的桑树，品种分别是鸡桑属（Morus aust⁃ralis Poir.）的屏边鸡桑，鲁桑属（Morus multicaulis Perr.）的皖桑1号、皖桑2号、皖桑优1号、华明桑、7707、红星5号、逆水千曲、强桑1号、湖桑32、孪枝桑、金寨龙桑、新大叶瓣、昌盛、鲁扦1号、晋桑9号、杂选花叶，山桑属（Morus mongolica Bur.）的剑持，白桑属（Morus alba Linn.）的农桑8号、湖桑199、湘7920。于2013年10月中旬分别采摘皖桑1号等22个桑品种的桑叶，于2014年分期采摘春（4月中旬）、夏（7月中旬）、秋（10月中旬）3个季节皖桑1号、皖桑2号、皖桑优1号、华明桑、红星5号和强桑1号6个桑品种的桑叶，于2014年10月中旬分别采摘皖桑1号、皖桑2号、皖桑优1号和强桑1号4个桑品种的桑叶，桑枝顶部、中部和基部的枝条，桑树主干基部的树皮。所有样品的桑叶均选取桑树当年生枝条中部的叶片，桑枝条均选取当年生各部位的长约2 cm的枝条，桑树主干基部的树皮均选取主干贴地面部位约2 cm2的树皮。将采集的所有桑树样品经DHG电热恒温鼓风干燥箱55℃烘干至恒质量，经超微粉碎机粉碎后过100目筛，4℃低温密封保存备用。

1.1.2 主要试剂芦丁标准品（纯度＞99%），购自于Sigma公司；乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠等试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器与设备 UV－1700紫外分光光度计，日本岛津公司产品；DHG电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；超微粉碎机，荣德精密科技股份有限公司产品；FA1204N分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；电子恒温水浴锅，上海启前电子科技有限公司产品；台式冷冻高速离心机，德国Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 测定样品液的制备称取以上桑叶、桑枝不同部位及桑树主干样品各0.2 g，分别以1∶30体积比用80%乙醇提取，置于80℃水浴中提取120 min；在8 000 r／min的条件下离心20 min，取上清液加80%乙醇定容至6 mL，得样品总黄酮待测液，备用，各样品设3个重复。

1.2.2 芦丁标准曲线的绘制精确称取芦丁标准品10 mg，加适量80%乙醇使其溶解，定容于50 mL容量瓶中，摇匀，得0.2 g／L芦丁标准品对照液；精确量取芦丁标准品对照液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL于25 mL容量瓶中，补加80%乙醇至5 mL，加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀后放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液10 mL，用80%乙醇稀释至25 mL，摇匀，得芦丁对照液；在吸光度最大的510 nm处，测定其吸光度。

1.2.3 总黄酮含量测定采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法［16］测定提取液中的总黄酮含量。取待测液1 mL，置于25 mL容量瓶中，加80%乙醇至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀后放置6 min；加10%硝酸铝溶液1 mL，混匀后放置6 min；加4%氢氧化钠溶液10 mL，以80%乙醇定容至25 mL，混匀，放置15 min，在吸光度最大的510 nm处，测定其吸光度，每个样品重复测定3次，取平均值，计算总黄酮含量。总黄酮含量（mg／g）＝（X×25.00× 0.006 0）／0.20，其中X＝（Y－0.005 3）／10.889 0，Y为吸光度，X为提取液总黄酮浓度。

1.2.4 精密度和重复性试验按“1.2.1”的方法制备皖桑1号桑叶总黄酮提取液，平行制备5份，按“1.2.3”的方法检测计算总黄酮含量及相对标准偏差（RSD），重复5次。

1.2.5 稳定性试验取皖桑1号桑叶总黄酮提取液，分别间隔0、10、15、20、25、30、35、40 min后，按“1.2.3”的方法测定其吸光值，重复5次，计算分析其总黄酮含量。

1.2.6 回收率测定分别精确称取已知总黄酮含量的皖桑1号桑叶烘干粉末5份样品（约2 g／份），按“1.2.1”的方法制备桑叶总黄酮提取液，精确加入质量浓度为0.2 mg／mL的芦丁标准品溶液1 mL，按“1.2.3”的方法测定，重复5次，计算其加样回收率。

1.3 数据处理

试验数据处理采用Excel和SPSS19.0数据分析软件进行统计分析，均以平均值±标准差（¯x±s）表示，采用Duncan多重比较法进行差异显著性多重比较。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准工作曲线和回归方程

以标准品对照液质量浓度为X轴，以吸光度为Y轴，绘制标准曲线，经线性拟合建立总黄酮吸光度（Y）与标准品对照液质量浓度（X）之间的线性回归方程：Y＝10.889 0 X＋0.005 3，R2＝0.999 8，芦丁标准品质量浓度在4～400 μg／mL范围内与吸光度显现良好的线性关系（图1）。

图1 芦丁标准工作曲线

2.2 不同桑树品种桑叶的总黄酮含量比较

从表1看，4个桑属22个桑品种桑叶的总黄酮含量差异极显著（P＜0.01），含量变幅为25.79～63.14 mg／g，桑叶总黄酮质量分数超过50.00 mg／g的有6份，其中湖桑199和皖桑2号2个品种中桑叶总黄酮的质量分数最高，分别高达63.14 mg／g和58.57 mg／g；桑叶总黄酮质量分数在30.00 mg／g以下的有2份，杂选花叶的桑叶总黄酮质量分数最低，为25.79 mg／g；其余14个桑品种的桑叶总黄酮质量分数在30.00～50.00 mg／g之间，可作为桑树药食用品种的育种素材或直接用作桑叶药食用产品的开发利用。

表1 不同桑品种桑叶的总黄酮含量情况

2.3 不同季节桑叶的总黄酮含量变化

从不同季节桑叶的总黄酮含量变化情况（图2）可以看出，皖桑1号、皖桑2号、皖桑优1号、华明桑、红星5号和强桑1号6个桑品种中，除华明桑外，皖桑1号等5个桑品种不同季节桑叶总黄酮含量的变化趋势是一致的，夏季桑叶的总黄酮质量分数显著低于春季和秋季桑叶的总黄酮质量分数（P＜0.05），平均为33.52 mg／g，春季和秋季桑叶的总黄酮质量分数无显著差异（P＞0.05），其中春季最高，平均为52.10 mg／g，这是因为夏季温度过高或是环境中光辐射较强，抑制了黄酮成分的合成积累［18－19］。华明桑秋季桑叶的总黄酮质量分数高于春季桑叶的总黄酮质量分数，分别为52.90 mg／g和45.76 mg／g。

图2 2014年不同季节桑叶的总黄酮含量变化情况

2.4 桑树不同部位的总黄酮含量变化

从同一季节桑树不同部位的总黄酮含量情况（图3）可以看出，皖桑1号、皖桑2号、皖桑优1号和强桑1号4个桑品种桑树不同部位的总黄酮含量变化趋势一致，桑叶的总黄酮平均质量分数最高，为42.30 mg／g，远高于枝条各部位、树干基部树皮等部位，差异极显著（P＜0.01）；皖桑2号桑叶的总黄酮质量分数最高，达58.57 mg／g；树干基部树皮的总黄酮质量分数显著高于枝条各部位的总黄酮质量分数（P＜0.05），其总黄酮平均质量分数为18.27 mg／g；枝条上部、中部、下部的总黄酮质量分数无显著差异（P＞0.05）。

图3 桑树不同部位的总黄酮含量情况（2014年10月）

2.5 精密度和重复性测试结果

5次测定皖桑1号的桑叶总黄酮含量，结果见表2，相对标准偏差为0.28%，说明采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法测定样品总黄酮含量的方法可行性好，精密度高，重复性好。

表2 精密度和重复性测试结果

2.6 稳定性测试结果

将桑叶总黄酮提取液经显色反应后于4℃放置不同时间，分别测定不同时间点样品的总黄酮含量，结果见表3，在20 min以内，桑叶提取液的总黄酮含量是稳定的，随着时间的增加，总黄酮含量明显降低，相对标准偏差为4.23%，表明提取液经显色反应后稳定性较差，试验中需尽快完成检测。

表3 稳定性测试结果

2.7 回收率测试结果

在桑叶总黄酮提取液中加入一定量芦丁标准品进行总黄酮回收率测定，结果见表4；由表4可知，桑叶总黄酮的平均加样回收率为99.96%，其相对标准偏差为0.88%。

表4 桑叶总黄酮加样回收率测试结果

3 小结与讨论

本试验采用Al（NO3）3－NaNO2分光光度比色法，综合考虑不同桑品种、桑树不同部位、不同季节等因素，对桑树总黄酮含量的变化规律进行了探讨分析，为富含总黄酮药食用途桑品种育种及其开发利用提供生物资源。该方法操作简便、精密度高、重复性好，适宜于总黄酮含量的测定。试验结果表明，鲁桑、白桑、山桑、鸡桑等4个桑属22个桑品种桑叶的总黄酮含量差异极大（P＜0.01），含量变幅为25.79～63.14 mg／g，湖桑199桑叶的总黄酮含量最高，杂选花叶桑叶的总黄酮含量最低，与刘利等［14］的测定结果相近，比李平平等［20］的测定结果高；除华明桑外，皖桑1号等5个桑品种不同季节桑叶的总黄酮含量以春季最高，夏季最低，且差异显著（P＜0.05），另有研究表明，桑叶11月份经霜后，桑叶的总黄酮含量会继续上升至最高，超过春季桑叶的总黄酮含量［21］；同一季节桑叶的总黄酮含量远高于枝条各部位、树干基部树皮等部位，且差异极显著（P＜0.01），树干基部树皮总黄酮含量显著高于枝条各部位（P＜0.05）；由于试验选材桑树品种未能统一，海拔对桑树总黄酮含量的影响规律及合成积累机制还需进一步研究。

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