不同强度耐力运动对骨骼肌质量的影响:自噬与衰老

邱守涛，崔 迪，付绍婷，张蕴琨，陈彩珍，卢 健

(1.青少年健康评价与运动干预教育部重点实验室，上海 200241;2.华东师范大学体育与健康学院，上海 200241;3.南京体育学院，江苏南京 210014)

骨骼肌是机体重要的运动器官，实现了生物能向机械能的转换，以维持机体复杂的身体活动，同时为应对复杂的生理环境如激素水平、身体活动状态。骨骼肌表现为结构及功能的可塑性，如规律性耐力运动可有效增加骨骼肌氧化磷酸化水平并减缓疲劳发生，而身体活动不足或生理、病理性骨骼肌废用则导致肌萎缩、骨骼肌功能下降，影响机体生活质量并增加代谢性及退行性疾病发生的风险［1］。衰老过程中，机体骨骼肌质量、力量及功能逐渐下降，称为骨骼肌衰减征(Sarcopenia)［2－3］。随着我国老龄化程度加剧，老年人骨骼肌衰减发生率骤增，不仅影响了其健康水平和自理能力，甚至危及其生命，给社会及家庭带来沉重负担，因此探究骨骼肌衰减的发病机制及防控策略成为老年医学、预防医学及运动科学研究的重要问题。衰老进程中骨骼肌衰减的病理生理机制尚不明确，研究表明炎症反应、细胞凋亡、线粒体功能障碍及蛋白质合成与降解等均参与其中［4］。细胞自噬(以下简称自噬)是真核细胞内重要的分解代谢途径，通过对细胞内错误折叠的蛋白质、受损的细胞器及病原体等的清除参与调控细胞正常生理功能［5］。研究表明，自噬水平的上调对糖尿病、癌症及退行性疾病的防治有广泛的健康效益，而运动则是刺激自噬水平上调的安全且有效的“良药”，从而揭示了运动对健康的促进作用［6－7］。那么，衰老过程中骨骼肌自噬水平的变化如何，是否与骨骼肌衰减相关，不同强度耐力运动是否通过作用于自噬调控衰老引起的骨骼肌衰减?因此，本文采用SAMP6(Senescence accelerated mouse prone 6)快速老化小鼠为实验对象并对其进行不同强度的耐力运动干预，观察衰老进程中骨骼肌质量和自噬水平的变化及运动对其影响，探究衰老、运动、骨骼肌质量与自噬的内在联系，旨在为骨骼肌衰减的运动防治机制提供理论和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

3月龄雌性SAMP6快速老化小鼠20只，体重(27.41 ± 5.12)g，SAMR1(Senescence accelerated mouse resistant 1)小鼠5只，体重(27.43±5.17)g，由天津中医药大学第一附属医院提供，标准啮齿类动物饲料喂养，自然光照周期，自由进食、饮水。适应性喂养一周后，SAMP6小鼠随机分为安静组(P，n=5)、高强度耐力运动组(PH，n=5)、中强度耐力运动组(PM，n=5)和低强度耐力运动组(PL，n=5)，SAMR1小鼠为正常对照组(R，n=5);PH、PM、PL组小鼠进行为期8周的跑台耐力运动，速度分别为28、18、8 m/min，坡度为 5°，每天 50 min，一周运动 6次，周日休息。末次运动结束12h后，处死小鼠并取双侧腓肠肌称重、待测。

1.2 指标检测

1.2.1 骨骼肌HE染色 取一侧腓肠肌水平面截取远端一半，用4%多聚甲醛固定，经脱水、透明、浸腊、包埋制成石蜡标本，转轮切片机连续切片，厚度为6 μm，进行常规HE染色(Hematoxylin-eosin staining)，使用Leica成像系统(Qwin)显微镜下观察骨骼肌横断面，在200×视野下随机选取5个视野，采用Image-Pro Plus 6.0软件计算骨骼肌肌纤维相对横截面积。

1.2.2 Real-time PCR检测mRNA表达 冰上取腓肠肌约50mg，采用 Trizol(Invitrogen)试剂提取总RNA，超微量分光光度计(Nanovue plus)检测OD260/OD280比值验证其纯度，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，反转录试剂盒(ABI 4368813)合成第一链cDNA，实时荧光定量PCR仪(ABI StepOne)检测骨骼肌质量相关基因MHC(Myosin heavy chain)、mTOR(Mammalian target of rapamycin)、MSTN(Myostatin)、MyoD1(Myogenic differentiation 1)及自噬相关基因 ULK1(Unc51-like kinase 1)、BECN1(Beclin 1，autophagy related)、ATG7(Autophagy related gene 7)、ATG13(Autophagy related gene 13)、MAPLC3(Microtubule-associated protein 1 light chain 3/LC3)、SQSTM1/p62(Sequestosome 1/p62)、LAMP2(Lysosomal-associated membrane protein 2)mRNA表达，内参为GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，荧光染料为 SYBRGREEN(TOYOBO QPK201)。实验所需引物由Prime-BLAST软件进行设计并反查，由上海生物工程有限公司提供合成服务，引物序列见表1。

1.2.3 Western Blot检测蛋白表达 冰上取一侧腓肠肌，按质量体积比1∶7加入含有蛋白酶抑制剂(Pierce 88663)的RIPA裂解液(Pierce 89900)，磁珠匀浆机(OMNI Bead Ruptor 24)匀浆，置于冰上裂解20 min，超低温离心机(Eppendorf 5804R)离心取上清(14 000 g，20 min，4 ℃)。BCA(Beyotime P0012)法定量后用PBS缓冲液将蛋白浓度稀释至10 mg/ml，加入2×loading缓冲液，95℃变性5 min后分装。50 μg总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将胶上蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4℃孵育过夜，0.05%TBST缓冲液洗涤4次，每次10 min，二抗室温孵育2 h，0.05%TBST洗涤 4次，每次 10 min，超敏 ECL(Bio-Rad 10026378)显色，Alpha凝胶成像系统(FC2)成像，FluroChem FC软件进行灰度值分析。实验所需抗体包括LC3(CST 2775s)、p62(CST 5114s)、GAPDH(杭 州贤至)及HRP标记羊抗兔二抗(CST 7074P2)。

表1 实验所需引物序列

1.3 数据分析

实验数据录入Excel 2007，结果以平均数±标准差表示，GraphPad 6.0进行数据统计分析及图像生成，组间比较采用独立样本T检验，组内比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异显著性水平，以P＜0.01为差异极显著性水平。

2 实验结果

2.1 小鼠体重及骨骼肌重量

与R组比，P、PH、PM、PL组小鼠体重均显著增加(P＜0.05)，P、PM、PL组小鼠骨骼肌质量(腓肠肌/体重)显著下降(P＜0.05);与P组比，PH组小鼠骨骼肌重量显著增加(P＜0.05)。

图1 小鼠体重及骨骼肌重量

2.2 骨骼肌HE染色

HE染色结果显示，P组小鼠骨骼肌肌纤维横截面积较R组显著下降(P＜0.05)，肌细胞间隙增大、形状不规则且出现核居中现象;与P组比，PH、PM、PL组小鼠骨骼肌肌纤维横截面积呈增加趋势，PH组肌纤维横截面积增加更为显著(P＜0.05)。

2.3 骨骼肌质量相关分子基因表达

与R组比，P组小鼠骨骼肌MHC1 mRNA表达显著下调(P＜0.05)，MSTN mRNA显著增加(P＜0.05)，MyoD1 mRNA 显著下降(P ＜0.05)，PH、PM、PL组MHC1、MHC2A及MHC2B较P组均呈增加趋势，但差异不具显著性;与P组比，PH、PM、PL组小鼠骨骼肌MSTN mRNA表达显著下调(P＜0.05)，MyoD1 mRNA表达呈上升趋势，差异不具显著性。

2.4 自噬相关基因表达

与R组比，P组小鼠骨骼肌p62 mRNA及蛋白表达显著增加(P＜0.05);与P组比，PH、PM、PL组小鼠骨骼肌 ULK1、ATG7、ATG13、LC3 mRNA 表达均显著下降(P＜0.05)，PH、PM组小鼠骨骼肌P62、LAMP2 mRNA表达均显著下降(P＜0.05)，PH、PL组BECN1 mRNA表达显著降低(P＜0.05)，PM组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高，PH、PM、PL组 p62蛋白表达均显著下调(P＜0.05)，且PM组小鼠骨骼肌LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著高于PL组。

图2 骨骼肌HE染色及肌纤维横截面积

图3 骨骼肌质量相关基因表达

3 讨论与分析

3.1 衰老过程中骨骼肌质量变化及耐力运动影响

SAMP6小鼠是快速老化小鼠的一种，是由日本京都大学Takeda教授采用AKR/J小鼠与其他品系小鼠杂交而获得的子代衰老动物模型，其寿命约为10.5月，表现为成年小鼠低峰值骨量、肌肉质量下降等［8］。Chen H等人研究发现，8月龄雌性SAMP6小鼠比目鱼肌横截面积较SAMR1(Senescence accelerated mouse resistant 1，SAMP6的同窝对照)小鼠显著降低，并认为该小鼠骨量下降源于骨骼肌收缩功能的降低［9］。本研究中，SAMP6小鼠处死时为5月龄，属于成年期动物，用于研究衰老进程中小鼠骨骼肌质量的变化，对制定骨骼肌衰减的早期防治措施具有重要的指导意义。Edstrom E将单个骨骼肌重量与体重的比值称为骨骼肌衰减指数(Sarcopenia index，SI)，用以描述骨骼肌衰减程度［10］。根据Morley JE等人的诊断标准，本研究中SAMP6小鼠体重显著增加，SI指数及肌纤维相对横截面积显著下降，肌细胞间隙增大、形状不规则且出现核居中现象，提示5月龄SAMP6小鼠发生骨骼肌衰减［2］。进一步研究发现SAMP6小鼠MyoD1及MHC1 mRNA表达显著下降，而MSTN表达显著增加，因此推测SAMP6小鼠骨骼肌衰减可能与骨骼肌蛋白质合成减少、肌肉生长抑制有关。MyoD是调节肌肉生长的重要因子，可促进其他类型细胞尤其是肌卫星细胞向骨骼肌细胞分化从而促进骨骼肌生长［11］。MSTN是骨骼肌分泌的肌肉因子，属于转化生长因子 β(Transforming growth factor β，TFGβ)家族，对骨骼肌生长起负向调控作用。Amirouche A等研究发现SD大鼠MSTN过表达导致胫骨前肌骨骼肌质量显著下降，且该作用是通过抑制AKT(Protein kinase B)/mTOR促合成信号通路实现的［12］。本研究中，SAMP6小鼠MSTN mRNA表达上调可能导致AKT/mTOR合成信号受阻，加之MyoD1表达下降可能导致卫星细胞的活化修复机制下降，最终引起骨骼肌衰减，而MHC1表达的下调也证实了这一点。有趣的是，衰老进程中骨骼肌质量的衰减并未伴随mTOR mRNA表达的下调，这可能是由于机体主要通过对mTOR的翻译后修饰对其功能进行调节。

图4 骨骼肌细胞自噬相关基因表达

运动干预结果显示，持续8周的不同强度耐力运动对SAMP6小鼠体重无影响，且仅高强度耐力运动可使快速老化小鼠骨骼肌重量适应性增加;HE染色结果与骨骼肌重量变化一致，提示8周高强度耐力运动可有效促进肌纤维肥大而增进骨骼肌质量。这可能是高强度耐力运动抑制骨骼肌MSTN的表达，解除其对AKT/mTOR信号的抑制，促进骨骼肌质量相关基因转录及翻译以增加骨骼肌质量，这与Murach K等的研究结果一致［13］。中、低强度耐力运动虽然降低了MSTN mRNA的表达，但骨骼肌质量及横截面积仅表现为增加趋势，说明耐力运动对骨骼肌质量的提高具有强度依赖性，其具体机制有待于进一步研究。

3.2 衰老过程中骨骼肌自噬变化及耐力运动影响

衰老过程中骨骼肌衰减的发生已得到学者广泛关注，从质量控制角度来看骨骼肌质量的维持主要涉及合成代谢与分解代谢两方面，而自噬无疑是除泛素-蛋白酶系统外胞内重要的分解代谢途径。自噬是一个复杂的动态变化过程，主要包括诱导、运载物的识别和包装、囊泡成核、囊泡扩展和闭合、ATG蛋白循环、囊泡与溶酶体融合、囊泡分解，大分子循环再利用［14］。自噬起始过程中，ULK复合物的激活至关重要，ULK1与ATG13是ULK复合物的重要组分，而mTOR可通过磷酸化ULK1、ATG13抑制ULK复合物的活性［15］。Beclin1与VPS34(Phosphoinositide-3-kinase class 3，PIK3C3)形成复合物，通过使其他ATG蛋白重定位到前自噬体结构而促进自噬体形成;ATG7参与ATG16复合物和LC3-PE(LC3Ⅰconjugated to phosphatidylethanolamine，LC3Ⅱ)的形成，二者参与自噬体膜的扩展、弯曲或囊泡闭合，LAMP2则主要参与细胞中自噬体与溶酶体的融合事件，其中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值是指征自噬水平的重要指标［16］。本研究发现，SAMP6小鼠衰老进程中自噬起始及囊泡成核相关基因 ULK1、BECN1、ATG7、ATG13及LC3 mRNA表达均无变化，而参与降解机制的分子p62转录及蛋白水平均显著上调，提示衰老过程中骨骼肌自噬水平异常主要表现在降解阶段，并非自噬的启动阶段。Salminen E及Bergamini A等人也相继报道了衰老动物模型骨骼肌自噬水平的下调，但与本研究结果不同的是，他们发现衰老小鼠自噬的激活及其降解功能均下降，而本研究中SAMP6小鼠骨骼肌仅表现为自噬降解功能的降低，这可能是由于本研究所采用的动物模型处于衰老早期，而Salminen E及Bergamini A所使用的实验动物处于衰老期［17－18］。本研究还发现，不同强度耐力运动使 SAMP6小鼠骨骼肌 ULK1、ATG7、ATG13、LC3 mRNA表达均显著下降，提示调节自噬启动的相关信号转录水平下调，而高强度及中强度耐力运动组小鼠骨骼肌P62、LAMP2 mRNA表达均显著下降，高强度及低强度组BECN1 mRNA表达显著降低(P＜0.05)，中强度耐力运动使LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著升高，3种强度耐力运动均使p62蛋白表达显著下调。以上结果提示，对衰老小鼠的运动干预过程中，骨骼肌细胞自噬启动相关因子表达下调可能是从分解代谢方面机体做出适应性反馈抑制，避免自噬过度激活缓解骨骼肌质量衰减所致;而由于衰老过程中自噬的降解机制障碍导致大量代谢废物或具有细胞毒性的物质异常堆积，耐力运动尤其是中强度耐力运动加速了自噬-溶酶体对异物的降解过程，从而发挥对骨骼肌质量的保护作用;不同强度耐力运动对自噬相关基因表的影响略有差异，这可能是自噬相关基因表达对运动强度的敏感性不一致，其具体机制仍待进一步研究。

Pasini E等人对衰老Wistar大鼠的研究发现，大鼠股四头肌IRS-1(Insulin receptor substrate 1)及p-mTOR(Phosphorylated mammalian target of rapamycin)含量显著下降，导致骨骼肌合成代谢水平下调引起骨骼肌质量下降，而耐力运动则可显著增加mTOR的活性缓解这一现象［19］。然而，整合生理学的发展使人们认识到，合成代谢与分解代谢密不可分、相互制约，mTOR就是联系蛋白质合成与自噬降解两种机制的分子之一。研究表明热量限制(caloric restriction，CR)是激活自噬的有效手段，一方面CR可下调mTOR信号通路的活性，减弱后者对ULK1复合物的抑制作用而促进自噬的诱导;另一方面CR可提高AMPK(AMP-activated protein kinase)及Sirt1的活性，Sirt1可通过去乙酰化ATG5、7、8 提高细胞自噬水平［17，20］。本研究中 3 种不同强度耐力训练均可激活自噬，并使SAMP6小鼠的自噬降解功能恢复正常，其分子机制可能与CR促进自噬相似，即通过AMPK/Sirt1信号通路的激活最终调控细胞自噬水平适应性增加。运动与骨骼肌细胞自噬的研究表明，为期4周或终身自主运动可促进衰老大鼠ATG7、ATG9及LC3蛋白表达增加以上调骨骼肌自噬水平，且伴随机体运动能力相应增加，表明自噬在骨骼肌收缩及功能执行方面也发挥重要作用，该报道与本文研究结果一致［21－22］。由此，运动对骨骼肌自噬的激活可能促进胞内受损的蛋白质及细胞器清除，减少这些物质对细胞的毒性作用，保持骨骼肌细胞正常的生理功能;同时，自噬降解所产生的生物大分子又成为合成代谢的底物，对骨骼肌细胞的结构和功能重塑提供物质基础，从这两方面看来骨骼肌自噬对骨骼肌衰减的防治具有重要意义。

值得注意的是，衰老进程中小鼠骨骼肌质量的降低伴随着自噬水平低下，而抑制自噬反而触发肌肉萎缩及各种肌病，提示细胞自噬可能对于骨骼肌质量具有双重保护机制［23］。Masiero E等人发现骨骼肌特异性敲除ATG7引起小鼠肌纤维蛋白聚集、线粒体异常、氧化应激等，引起严重的肌肉萎缩及增龄性肌力下降，提示自噬对于维持骨骼肌质量不可或缺［24］。本实验中SAMP6小鼠骨骼肌自噬激活正常但其降解功能下降，可能使肌纤维中异常的线粒体堆积导致促凋亡因子的释放和更多活性氧(Reactive oxygen species，ROS)产生，后者对蛋白、DNA 及细胞器造成氧化损伤，这些损伤的蛋白质及细胞器主要通过自噬及泛素-蛋白酶体系统清除，但此时骨骼肌自噬降解能力的下降，直接导致蛋白聚集、受损线粒体及内质网等大量堆积产生细胞毒性，触发细胞凋亡导致骨骼肌衰减。自噬是骨骼肌细胞蛋白质降解的重要途径之一，mTOR是调控蛋白质合成的重要信号分子，而且mTOR可使ATG13和ULK1高度磷酸化而抑制自噬，本研究发现衰老进程中骨骼肌质量及自噬水平均下降，这似乎是矛盾的;然而许多研究证实在成年动物骨骼肌中mTOR信号通路不是自噬的主要调控途径［15，25，26］。Zhao J 等人发现，采用雷帕霉素(mTOR的抑制剂)处理分化的肌管仅能使蛋白降解增加10%，在体研究结果与此相似，可见骨骼肌质量下降与自噬水平同时下降并不矛盾，但其具体分子机制仍需进一步研究［27］。自噬如同一把双刃剑，过度自噬引起肌肉萎缩，自噬不足亦会导致肌纤维结构与功能异常导致肌肉衰减，表明通过不同干预手段维持骨骼肌适宜的自噬水平可能是防治骨骼肌衰减关键所在。尽管细胞自噬对于骨骼肌质量及功能的维持具有重要作用，但是在本研究中高强度耐力运动显著提高了SAMP6小鼠骨骼肌质量，而中等强度耐力运动则显著提高了骨骼肌自噬水平，两者并不完全一致，是高强度耐力运动在提高自噬水平的同时还上调mTOR信号通路以促进骨骼肌蛋白质合成，还是中等强度耐力运动引起的自噬水平过度上调导致骨骼肌分解加强，尚待进一步研究。

综上所述，衰老进程中小鼠骨骼肌自噬的诱导和成熟处于正常水平，但其降解机制发生障碍，是骨骼肌衰减的诱因之一;8周的不同强度耐力训练均可缓解SAMP6小鼠自噬降解障碍以维持肌细胞正常生理功能，中等强度的耐力运动对SAMP6小鼠骨骼肌自噬水平的激活更为有效。

4 结论

1)SAMP6小鼠较SAMR1小鼠体重增加而骨骼肌重量显著降低，提示雌性快速老化小鼠发生骨骼肌衰减，不同强度耐力运动均可促进快速老化小鼠骨骼肌重量适应性增加，而高强度耐力运动可有效缓解快速老化引起的骨骼肌重量下降;2)衰老进程中，并非细胞自噬的应答及启动机制而是其降解机制发生障碍导致快速老化，小鼠骨骼肌自噬水平降低引发骨骼肌衰减，耐力运动尤其是中等强度耐力运动可有效促进自噬降解从而缓解骨骼肌衰减，这可能是运动调控骨骼肌质量的重要机制之一。

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