姜黄素对前列腺癌PC3细胞迁移的抑制作用及对MMP2体内外表达影响❋

齐瑞芳，于小玲，赵 辉

(1.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014060; 2.青岛大学医学院病理生理教研室，山东青岛 266021)

姜黄素对前列腺癌PC3细胞迁移的抑制作用及对MMP2体内外表达影响❋

齐瑞芳1，2，于小玲2△，赵 辉2

(1.包头医学院基础医学与法医学院，内蒙古包头 014060; 2.青岛大学医学院病理生理教研室，山东青岛 266021)

目的:观察不同浓度姜黄素对前列腺癌PC3细胞侵袭浸润的抑制作用以及对金属基质蛋白酶2(MMP2)表达的影响。方法:采用细胞划痕实验观察姜黄素对PC3细胞迁移能力的影响;建立PC3裸鼠移植瘤，western blotting检测PC3细胞和移植瘤组织中MMP2蛋白的表达，实时荧光定量PCR检测MMP2 mRNA的表达。结果:姜黄素可减弱PC3细胞的迁移浸润能力，并下调MMP2的表达且呈剂量依赖性。结论:姜黄素可有效地抑制PC3细胞的迁移能力，下调MMP2的表达。

姜黄素;前列腺癌;侵袭;MMP2

中药姜黄具有破血行气、通经止痛之功效，其主要有效成分为姜黄素(curcumin)［1］。姜黄素曾作为食物上色和佐餐剂广泛用于食品工业［2］。近些年，姜黄素的药理作用不断被研究发现，如抗炎、抗氧化、抗动脉硬化等，尤其是抗癌抗肿瘤作用被人们逐步认识并受到广泛重视。本研究通过采用不同浓度的姜黄素作用于体外前列腺癌PC3细胞和体内PC3细胞裸鼠移植瘤，观察姜黄素对PC3细胞迁移浸润能力的影响，并检测与PC3侵袭浸润能力有关系的金属基质蛋白酶2(matrix metalloproteinases MMP2)的表达。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人雄激素非依赖性前列腺癌细胞株—PC3细胞购自中国科学院细胞库;胎牛血清、RPMI1640培养液购自美国GIBCO公司;胰蛋白酶、DMSO、BSA购自美国Solarbio公司;荧光定量PCR反应试剂盒; Trizol购自大连Takara公司;PMSF、细胞蛋白裂解液购自碧云天生物科技有限公司;MMP2多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，姜黄素购自Sigma公司(DMSO稀释成50mmol/L母液保存于-20℃，用时室温融化);实时荧光定量PCR仪购自基因公司; Olympus IX70-142倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 前列腺癌PC3细胞的培养 人前列腺癌细胞PC3培养于含10%(体积分数)胎牛血清的RPMI1640培养液中，37℃、5%(体积分数)CO2条件下培养。

1.2.2 裸鼠移植瘤的建立 BALB雄性SPF级裸鼠24只，鼠龄4周，体质量15～18 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。在恒温(25～27℃)、恒湿(40% ～60%)、无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)条件下饲养。实验前动物饲养2周适应环境。PC3细胞传代培养3～4代，取对数生长期细胞胰酶消化，无血清的培养液或PBS洗涤。离心收集细胞，按照10×107/ml用PBS制成细胞悬液，每只抽取0.2 ml细胞悬液注射于右侧腋窝处皮下，每天观察记录肿瘤形成情况。当肿瘤直径达3 mm3时，将裸鼠按随机数字表法分为4组各6只，腹腔注射药物0.2 ml/次共30 d。①空白对照组生理盐水隔日1次;②姜黄素组将姜黄素分为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3组，隔日1次。

1.2.3 细胞侵袭划痕实验 在24孔板中加入5×105个细胞常规培养，待细胞长满融合，用细胞刮划一约2 mm的线，PBS冲洗刮掉的细胞，然后加入不同浓度的姜黄素，无血清培养基继续培养24 h，观察细胞向无细胞划痕区域迁移的情况。每组设4个复孔，试验重复3遍。每孔中随机拍6个视野的划痕照片，细胞迁移的平均距离用JD801形态学图像分析系统来测量计算。

1.2.4 Western blotting检测MMP2蛋白表达

按说明书加入PMSF和细胞裂解液常规提取PC3细胞及移植瘤组织中的蛋白，BCA法蛋白定量，每孔加入等量的蛋白进行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。将蛋白电转到硝酸纤维膜上，用5% BSA封闭1 h，加一抗稀释液(1∶100稀释)4℃过夜，TTBS洗膜，结合辣根过氧化物酶标记二抗(1∶200稀释)，TTBS洗膜，用ECL化学发光试剂在X光胶片上曝光、显影、定影。以actin为内参，应用凝胶成像分析系统进行条带扫描分析，结果以蛋白条带的面积积分值与actin的面积积分值比值表示。

1.2.5 实时荧光定量PCR检测MMP2 mRNA的相对表达量 用Trizol提取细胞及移植瘤组织中的总RNA，用分光光度计测定其OD值，检测其纯度。如OD260/OD280在1.8～2.0之间，表明无蛋白质污染。逆转录以DNA为模板进行PCR扩增。实时荧光PCR引物由大连宝生物公司设计合成，MMP2上游引物序列:5'-GATAACCTGGATGCCGT CGTG-3';下游引物序列:5'-CAGCCTAGCCAGTCGG ATTTG-3'。以GAPDH为内参，上游引物序列:5'-AAATGGTGAAGGTCGGTGTG-3';下游引物序列为: 5'-TGAAGGGGTCGTTGATGG-3'。Real time PCR反应条件:94℃ 3 min，90℃ 30 s，60℃ 45 s，共40个循环。所有实验管均采用双管取其平均值，所有PCR产物再经琼脂糖凝胶电泳证实为特异性条带。用Real time PCR得到MMP2 mRNA的CT值分别与其相对应GAPDH的CT值相减进行校正得到校正CT值(即ΔCT)。以前列腺癌细胞空白对照检测到的GAPDH mRNA荧光均值作为参数，目的基因相对表达 量 的 拷 贝 数 计 算 公 式［3］: 2-ΔΔCT= 2-(ΔCT目的基因-ΔCT对照基因)。

1.2.6 统计学方法 采用SPSS 12.0统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素对PC3细胞划痕侵袭实验

表1图1显示，未加药物对照组24 h后与加药前比较，细胞呈梭型生长并向划痕区伸出伪足，细胞间距明显缩小;姜黄素组在5～30 μmol/L范围内随着药物浓度的增加，细胞向划痕区迁移生长的能力明显降低，差异有统计学意义。

表1 姜黄素对PC3细胞迁移距离的影响

图1 划痕实验检测姜黄素对PC3细胞迁移能力的影响

2.2 姜黄素对MMP2蛋白表达的影响

为进一步研究姜黄素对PC3细胞侵袭浸润能力的影响，用 Western-Blot的方法检测与PC3细胞侵袭浸润能力有关的MMP2蛋白表达情况。实验结果显示，5～30μmol/L的浓度范围内随着药物浓度的增加，PC3细胞中MMP2蛋白表达呈逐渐下降趋势(见图2);同样裸鼠移植瘤中MMP2蛋白的表达随姜黄素浓度增加而逐渐减弱(见图3)，说明姜黄素可下调MMP2蛋白表达。

2.3 实时荧光定量PCR检测MMP2 mRNA的表达

表2、3显示，用Realtime PCR检测PC3细胞和PC3细胞裸鼠移植瘤组织中MMP2 mRNA相对表达量的变化，结果表明姜黄素可降低MMP2 mRNA的表达，并呈现剂量依赖性，差异有统计学意义。

表2 姜黄素对PC3细胞MMP2 mRNA相对表达量的影响

表3 姜黄素对PC3细胞移植瘤组织MMP2 mRNA相对表达量的影响

图2 姜黄素对PC3细胞MMP2蛋白表达的影响

3 讨论

前列腺癌在美国位于男性恶性肿瘤发病率的第一位、死亡率第二位［4］。在中国虽然发病率比较低，但死亡率较高，且随着我国老龄化社会的进入，前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势，已成为影响老年男性健康的一大疾患。其发病隐匿，发现时多已发生转移，成为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)，甚至是难治性的前列腺癌(HRPC)。目前临床上虽有外科手术疗法、激素疗法、化学药物疗法等多种治疗方法，但没有一种方法能明显提高前列腺癌患者的存活率，所以寻找有效的综合治疗方法显得更加迫切。目前采用中医药治疗晚期前列腺癌已得到许多中西医同行的认同，并成为新的研究热点。

本研究通过体外培养前列腺癌PC3细胞并建立PC3细胞裸鼠移植瘤，采用细胞划痕实验观察不同浓度姜黄素对PC3细胞迁移浸润能力的影响，然后通过western blotting方法检测与侵袭浸润能力有关的MMP2蛋白的表达，用实时荧光定量PCR检测MMP2 mRNA表达，发现姜黄素可以抑制PC3细胞的侵袭浸润能力，下调MMP2蛋白及mRNA的表达，这将对临床开发综合治疗方法提供重要的理论依据。

近年来，姜黄素作为被研究的热点抗肿瘤药物，其抗肿瘤作用机制比较复杂，目前普遍认为可能主要与抑制肿瘤细胞增殖［5］、诱导肿瘤细胞凋亡［6］、抑制肿瘤细胞侵袭与转移［7］等有关。本课题组研究表明，姜黄素可抑制前列腺癌PC3细胞生长并促进其凋亡［8］。此外，姜黄素作为抗癌药除具有常用抗肿瘤药物的作用外，还有其自身的特点，如保护胃肠道、心血管系统、肝脏和肾脏功能等功能［9］，减轻化疗药物的毒副作用。如将其用于临床，对于延长患者生命、提高生活质量会起到非常关键的作用。目前对姜黄素的药效研究还处于实验阶段，主要原因是姜黄素在肠道不易吸收，口服后的系统生物利用度相对较低。但是姜黄素具有抗癌谱广、毒副作用小等优点，仍被肿瘤学家们认为是一种潜在的第三代抗肿瘤药。

［1］贾绍华，张舜尧.姜黄素药理作用研究进展［J］.中国现代药物应用，2009，3(22):188-189.

［2］Epstein J，Sanderson I R，Macdonald T T.Curcumin as a therapeutic agent:the evidence from in vitro，animal and human studies［J］.Br J Nutr，2010，9(1):8-14.

［3］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C (T)Method［J］.Methods，2001，25(4):402-408.

［4］Ahmedin Jemal，Elizabeth Ward，Michael Thun，et al，Declining Death Rates Reflect Progress against Cancer［J］.PLoS One，2010，5(3):e9584.

［5］李彧，李亚东，华颖，等.姜黄素对转化生长因子-β1诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖及Smads信号通路的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2013，19(8):902-906.

［6］孔涛，杨静哲，代宏亮，等.姜黄素对人膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2011，17(5): 527-528.

［7］Abdullah Thani NA1，Sallis B，et al，Induction of apoptosis and reduction of MMP gene expression in the U373 cell line by polyphenolics in Aronia melanocarpa and by curcumin［J］. Oncol Rep，2012，28(4):1435-42.

［8］Yu XL，Jing T，Zhao H，et al，Curcumin inhibits expression of inhibitor of DNA binding 1 in PC3 cells and xenografts［J］. Asian Pac J Cancer Prev，2014，15(3):1465-1470.

［9］许东晖，王胜，金晶，等.姜黄素的药理作用研究进展［J］.中草药，2005，36(11):1737-1740.

Inhibition of Curcumin on Prostate Cancer PC3 Cell Invasion and Its Effect on the Expression of MMP2 in Vivo and in Vitro

QI Rui-fang1，2，YU Xiao-ling1△，ZHAO Hui2
(1．Preclinical and Forensic Medicine of Baotao Medical College，Inner Mongolia Baotao 014060，China; 2．Department of Pathophysiology，Medical College of Qingdao University，Shandong Qingdao 266021，China)

Objective:To observe the inhibitory effect of different concentrations of curcumin on prostate cancer PC3 cells and the effect on matrix metalloproteinase 2(MMP2)expression.Methods:Using Scratch test to observe the capacity of migration in PC3 cells;Prostate cancer cells PC3 xenografted tumors in nude mice were used.western blotting was applied to examine the protein of MMP2 in cell and xenografted tissues，real-time quantitative PCR was used to detect MMP2 mRNA.Results:Curcumin reduced the migratory ability of PC3 cells and downregulate the expression of MMP2，showing a dose-dependent manner.Conclusion:Curcumin can effectively inhibit the migratory ability of PC3 cell，reduced expression of MMP2.

Curcumin;Prostate cancer;Invasion;MMP2

R285.5

:B

:1006-3250(2015)11-1398-03

2015-05-09

包头医学院秦文斌基金(201107)

齐瑞芳(1982-)，女，内蒙古包头人，讲师，医学硕士，从事肿瘤的基因诊断及防治研究。

△通讯作者:于小玲(1964-)，女，山东人，副教授，医学博士，硕士研究生导师，从事肿瘤的基因诊断、防治及药理药代研究。