siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

路伟，冯震，阎超

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)



siRNA联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达影响

路伟，冯震，阎超

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

目的 探讨小干扰RNA(siRNA)联合预照射对肺癌细胞survivin基因表达的影响。方法 在肺癌A549细胞中转染survivin基因的siRNA，分别用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western Blotting方法检测survivin基因mRNA和蛋白的表达。将肺癌A549细胞分为单纯放射组、单纯转染组、转染+放射组，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，采用细胞集落形成实验检测细胞增殖情况，采用CCK8测细胞生长曲线。结果 siRNA能抑制肺癌细胞survivin基因mRNA和蛋白的表达。siRNA联合预照射较单纯转染和单纯放射能显著增加细胞凋亡率，降低细胞的集落形成，抑制细胞生长。结论 预照射可以增强siRNA对肺癌细胞survivin基因的抑制作用。

肺肿瘤；RNA干扰；survivin基因；放射疗法

无论在发达国家还是发展中国家，肺癌的发病率和死亡率均居恶性肿瘤之首。survivin基因是一种凋亡抑制基因，高表达于各种恶性肿瘤中。survivin蛋白具有抑制细胞凋亡、参与细胞周期调控、促进细胞增殖和有丝分裂、促进血管增生等生物学功能，是肿瘤诊断和治疗的理想靶点之一。新开发的RNA干扰技术可以快速、有效地沉默靶基因的表达，已成为基因治疗的研究热点。该方法特异性强、抑制率高，已在实验研究、抗肿瘤基因治疗等方面得到广泛应用。本研究拟将RNA干扰技术用于survivin基因靶向治疗，并与放射治疗结合增强其转导率, 沉默肺癌细胞survivin基因的表达，消除其高表达引起的放化疗抗拒。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1主要材料

人肺鳞状细胞癌A549细胞株由上海口腔医学重点实验室提供。DMEM购自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶购自Gibco公司；cDNA合成试剂盒和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(Takara)购自大连宝生物工程有限公司；Trizol及Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；硝酸纤维素膜(Qiagen)、BCA蛋白浓度测定液(Pierce)及蛋白Marker(Fermentas)购自碧云天公司；β-Actin抗体和survivin抗体(Abcam)均为单克隆抗体，购自上海优宁维生物公司；survivin小干扰RNA(siRNA)(Biomics)购自上海艾双生物公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 肺癌A549细胞使用含有体积分数为0.10 FBS、105U/L青霉素和105U/L链霉素的DMEM培养液在37 ℃、体积分数0.05的CO2及饱和湿度的条件下培养。

1.2.2survivin蛋白的Western Blotting检测 将肺癌A549细胞分为空白组(A549组)、阴性对照组(NC组)、siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组。取各组对数生长期细胞，弃培养液，PBS冲洗3次后用

蛋白裂解液于冰上裂解20 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min，上清液用BCA法测定蛋白浓度，将上样蛋白加入SDS凝胶加样缓冲液中，100 ℃加热5 min使蛋白变性。将处理后的样品加入SDS-PAGE凝胶中电泳分离，电压60 V电泳30 min使染料进入分离胶，将电压加至130 V电泳80 min，然后将蛋白质从凝胶电转移至硝酸纤维素膜上，于200 mA下转膜1 h，将膜放入封闭液中孵育2 h，TBST洗涤3次；加入survivin抗体4 ℃摇床上孵育过夜，TBST洗涤3次，加兔二抗于室温孵育1 h，TBST洗涤3次；加入显色液后扫膜，以β-Actin蛋白表达作为对照。

1.2.3survivin mRNA的RT-PCR检测 应用Trizol试剂从细胞中提取总RNA并测定浓度。用逆转录试剂盒合成cDNA，采用实时荧光定量PCR法检测survivin mRNA表达。逆转录条件:42 ℃ 60 min，70 ℃ 10 min。反应终止后置冰上冷却，于-20 ℃保存。PCR扩增条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环。重复检测3次，每次做3个复孔，分别计算同一样品3个复孔的ct值，以β-actin 作为内参照，分别计算上述各组2-△△ct，用以表示目的基因的相对表达量。

1.2.4脂质体介导的siRNA转染 将A549细胞接种于6孔细胞培养板，生长至90%～95%融合时弃培养液，采用转染试剂Lipofectamin 2000进行siRNA转染，转染4～6 h后，更换为含体积分数0.10 FBS的培养液继续培养。每种siRNA转染重复3次。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 将细胞分为空白组(A组)、阴性对照组(B组)、转染组(C组，转染采用siRNA1序列)，分别采用0、5、10 Gy照射剂量处理各组细胞，照射24 h后检测各组细胞凋亡率。然后单独采用5 Gy照射剂量处理上述3组细胞，于照射0、6、12、24 h检测细胞凋亡率。细胞凋亡率检测具体步骤：将对数生长期的肺癌细胞制成细胞悬液，离心弃上清液，PBS重悬，显微镜下计数，离心5 min，加入1×Binding Buffer 400 μL重悬，加入Annexin V 5 μL混匀，避光室温孵育15 min，加入PI染色液10 μL，混匀，冰上避光孵育30 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.6平板克隆形成实验 将细胞分为单纯转染组、单纯放射组、转染+放射组。给予相应处理，放射剂量均为5 Gy。取各组对数生长期的细胞，经2.5 g/L胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，梯度稀释后接种于直径为10 cm的培养皿(每皿103个细胞)中，待细胞贴壁后予以放射线外照射，继续培养2周，观察细胞生长情况。弃培养液，PBS洗涤2次， 用40 g/L多聚甲醛5 mL固定细胞1 h，去固定液，加适量GIMSA染色液染30 min，流水缓慢洗去染色液，将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，在低倍显微镜下计数大于50个细胞的克隆数并计算克隆形成率。克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%。每组细胞实验重复4次。

1.2.7CCK8法测定细胞生长曲线 细胞分组同1.2.6。各组每孔分别接种3×103个细胞于96孔细胞培养板中，用DMEM培养液于37 ℃、含体积分数0.05的CO2培养箱中培养24 h，然后弃培养液，每孔再加入CCK8至终质量浓度5 g/L，待蓝紫色结晶颗粒充分溶解后于570 nm处测吸光度值，每组设6个复孔，连续7 d，实验重复3次。然后以吸光度值为纵轴，时间为横轴绘制细胞生长曲线。

1.3统计分析

2 结 果

2.1肺癌细胞survivin mRNA及蛋白的表达

siRNA1组、siRNA2组survivin mRNA表达水平与A549组比较，差异有统计学意义(t=11.93、11.46，P<0.05)；NC组、siRNA3组与A549组比较，差异无显著性(P>0.05)。见图1。siRNA1组和siRNA2组 survivin蛋白的表达较NC组和A549组明显减弱。见图2。

2.2放射对survivin siRNA 转染肺癌细胞凋亡的影响

受到5、10 Gy剂量照射后，3组细胞的凋亡率均较0 Gy有不同程度增加，而且照射剂量越大细胞凋亡率越高。细胞凋亡率与照射剂量和转染均有关(F=200.15、232.35，P<0.01),且二者间有交互作用(F=270.34，P<0.01)。见表1。随着照射后时间的延长，各组细胞凋亡率均呈上升趋势；同一时间不同组间比较，转染组的细胞凋亡率增高明显。细胞凋亡率与照射时间和转染均有关(F=494.08、163.11，P<0.01)，而且二者间有交互作用(F=134.17，P<0.01)。见表2。

图1 不同处理组survivin mRNA的表达

图2 不同处理组survivin蛋白的表达

表1 不同剂量照射各组肺癌细胞凋亡率比较

表2 各组5 Gy照射后不同时间肺癌细胞凋亡率比较

2.3放射对survivin siRNA转染肺癌细胞增殖能力的影响

单纯转染组细胞克隆形成率为(44.4±4.73)%(n=4)，单纯放射组为(41.3±2.53)%(n=4)，而转染+放射组为(28.1±2.13)%(n=4)，单纯转染组的克隆形成率高于其他两组(F=26.97,P<0.01)。

2.4放射对survivin siRNA转染肺癌细胞生长能力的影响

单纯转染组吸光度为1.86±0.04(n=6)，单纯放射组为0.89±0.01(n=6)，转染+放射组为0.62±0.03(n=6)，单纯转染组的吸光度高于其他两组(F=50.32，P<0.01)。各组肺癌细胞生长曲线见图3。

3 讨 论

肺癌是当今世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，约50%的肺癌临床诊断时已属晚期，因此迫切需要寻找新的诊断指标和治疗方法[1]。现代分子生物学研究证明，肺癌的发生发展是一个多基因、多阶段、多步骤的复杂演进过程。survivin基因是目前发现的最强凋亡抑制因子，其编码的蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的新成员，该蛋白高表达于人类大多数恶性肿瘤细胞中，而在正常组织中呈低表达或不表达。目前研究已证实，survivin基因在细胞周期、细胞凋亡及肿瘤血管形成中均发挥着重要作用。相关研究报道，survivin基因在非小细胞肺癌中的表达率可高达96%[2-3]。本研究也进一步证实了survivin基因在肺鳞癌细胞株中的阳性表达。本实验采用脂质体直接转染的瞬时转染方式，但体外通过脂质体转染siRNA的转染率并不高，故有些学者采用预照射的方式来提高转染率。曾亮等[4]的研究结果表明，采用3 Gy的低剂量照射可使腺病毒载体Ad5-CMVlacZ介导的基因转染效率明显提高，同时使腺病毒基因与细胞基因组之间的整合率明显提高，细胞内lacZ基因表达时间也从20 d延长到50 d[4]。TANG等[5]研究显示，小鼠肺癌细胞受到2～40 Gy的γ线照射后，再感染AdCMVluc,可以导致细胞内luc基因编码产物呈剂量依赖性扩增，扩增率可达24倍，可以有效抑制肿瘤的生长。LEE等[6]用9 Gy的γ线照射成纤维细胞后，质粒的转移率较对照组提高1 400倍。SONG等[7]采用siRNA阻抑存活素在Hela细胞中的表达，可以有效提高细胞的放射敏感性。

图3 各组肺癌细胞生长曲线

本实验设计了3条survivin基因的干扰序列，结果证实，siRNA1和siRNA2两条序列的干扰作用最为明显，故在检测survivin的表达情况时选择了这两条序列进行实验。在后续的实验中因分组较多，转染组只选用了siRNA1序列。本文结果显示，siRNA能够从mRNA和蛋白水平抑制肺癌A549细胞survivin基因的表达，siRNA通过阻断survivin基因的表达可以明显促进细胞的凋亡，该结果与曾亮等[8]的研究相一致。但转染组与阴性对照组相比，差异无显著意义。综合相关文献[9-10]，本实验使用0、5、10 Gy的X射线照射细胞。本文结果显示，预照射联合siRNA较单纯siRNA能明显提高细胞凋亡率，预照射可以增强siRNA对细胞凋亡的影响。说明预照射可增强siRNA抑制细胞增殖的能力，预照射联合siRNA能显著抑制细胞的生长。

本研究创新性地将基因靶向治疗和放疗结合，这种治疗具有双重靶向作用，可能提高肿瘤局部药物浓度和转染效果，从而增加放化疗敏感性。本研究结果可以为转基因治疗进入临床提供理论基础，同时，也必将为肺癌及其他肿瘤的治疗提供一种新的思路和方法。

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(本文编辑 马伟平)

EFFECTS OF COMBINED PRE-IRRADIATION WITH SIRNA ON THE EXPRESSION OF SURVIVIN GENE IN LUNG CANCER

LUWei,FENGZhen,YANChao

(Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined siRNA with irradiation on expression of survivin gene in lung cancer cells.MethodsThe siRNA of survivin gene was transfected to A549 cells of lung cancer, the expressions of survivin gene RNA and protein levels in lung cancer cells were detected using reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western Blotting. The A549 lung cancer cells were divided into three groups as: radiation group, siRNA transfection group and transfection plus radiation group, using flow cytometry to detect cell apoptosis rate, cell colony forming experiment to test cell proliferation, and CCK8 to determine the cell growth curves.ResultsSurvivin siRNA could inhibit the expression of survivin RNA and protein. Combined siRNA with pre-irradiation increased the apoptosis versus irradiation alone, decreased cell colony formation, and inhibited the growth of cells, the differences were statistically significant.ConclusionPre-irradiation can enhance inhibition of survivin siRNA on lung cancer cells.

lung neoplasms; RNA interference; survivin gene; radiotherapy

2014-07-08;

2015-01-26

路伟(1987-)，女，硕士。

阎超(1971-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师。

R734.205

A

1008-0341(2015)03-0256-04