KiSS-1在卵巢癌免疫学诊断中的价值

李观华，潘志雄，刘晓峰，陈雪礼，薛国辉

(九江市第一人民医院/南昌大学附属九江医院，检验科332000)

卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一，也是死亡率最高的癌症之一，全球范围内每年新发卵巢癌患者超过22万人次[1]，而在我国每年每10万人中就有5个被诊断为新发卵巢癌[2]。临床上超过70%的患者就诊时已是晚期，而早期卵巢癌患者5年生存率可达70%～90%，晚期卵巢癌患者5年生存率则仅为20%～30%[3]。卵巢癌早期诊断并及时治疗，患者的存活率可高达90%[4]，因此早期及时准确诊断是改善预后的关键问题。病理组织检测是诊断肿瘤的金标准，但因早期未能及时发现，病理检测也较为困难，因而血清学检测成为早期研究的重点。

目前如CA-199、CA-125、CEA等糖类抗原已用于卵巢癌临床诊断[5]。关于其准确性和研究也有较多报道，但单独检测的灵敏度较低[6]，所以临床上常使用多种肿瘤标志物联合检测[7]，并配合病理检测来诊断，新型肿瘤标志物的研究成为焦点。KiSS-1基因最先是被鉴定为黑色素瘤转移的一种抑制基因，新近研究发现KiSS-1是多种癌症中的转移抑制因子[8]。已有大量的证据[9,10]表明KiSS-1表达下调与较差的临床预后密切相关，KiSS-1在肿瘤生物学中的作用可能是通过其与在多种肿瘤侵袭转移发挥重要作用的基质金属蛋白酶(MMP)相互作用发挥抑制作用的[11]。KiSS-1基因表达缺失同样存在于在卵巢癌中，但其应用于临床卵巢癌免疫学诊断则少见报道，我们前期研究通过克隆纯化KiSS-1蛋白并免疫动物提纯出兔抗人KiSS-1抗体[12]，并利用KiSS-1抗体和KiSS-1蛋白建立ELISA法，本研究利用前期建立的ELISA法检测卵巢癌患者血清KiSS-1蛋白水平，并结合其他糖类抗原检测，综合评价KiSS-1水平诊断价值，为卵巢癌早期临床诊断提供参考价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年1月至2014年6月在本院妇科由病理确诊的80例卵巢癌和卵巢良性肿瘤患者及同期体检中心26例健康体检者，分为以下三组进行研究：(1)健康对照组26例：为本院体检中心女性，各项功能均正常，无良性卵巢疾病史，年龄25～68岁，平均年龄42.2岁。(2)卵巢癌组62例：所有患者均为本院住院患者，经病理等检查确诊为卵巢癌，包括浆液性腺癌28例、黏液性腺癌19例、低分化腺癌15例。年龄在30～62岁，平均46.1岁。(3)卵巢良性肿瘤组18例：经病理确诊卵巢良性肿瘤，包括子宫肌瘤8例、卵巢囊肿5例、良性畸胎瘤5例，年龄27～55岁，平均38.3岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 三组受检人群均在清晨空腹时静脉采血5ml，2h内分离血清检测相关指标。

1.2.2 糖类抗原检测方法 运用罗氏Combs 6000化学发光分析仪检测血清糖类抗CA-125、CA-199、CEA水平。所有检测均按仪器及试剂说明书规范操作。 CA-125≥35U/ml、CA-199≥37 U/ml、CEA≥15μg/L判断为阳性，低于该界值判断为阴性。

1.2.3 KiSS-1检测方法 采用前期研究中得到及提纯的兔抗人KiSS-1分子多克隆抗体建立KiSS-1检测的双抗体夹心ELISA方法，具体如下：(1)包被：用pH 9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为0.55μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min。(简称洗涤，下同)。(2)加样：加一定稀释的待检样品100μl于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。(3)加酶标抗体：于各反应孔中，加入来自华美生物有限公司购买的新鲜稀释的辣根过氧化物酶酶标抗体(经滴定后的稀释度 100)，37℃孵育 0.5h，洗涤。(4)加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100μl，37℃10～30min。 (5)终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸50μl。立即在自动酶标仪上读取450nm吸光度值，空白孔凋零,反应孔内颜色越深，阳性程度越强,OD值越高，阴性反应为无色或极浅。结果判定：样品血清每份做2孔，取平均值判断结果，空白孔调零，选择7个正常血清和2个卵巢癌患者血清作为判断每批ELISA试验之间可靠性的指标；100例正常人血清OD值的平均值加2个标准差为判断临界值，高于此为阳性，低于此为阴性。ELISA检测阴性判定为KiSS-1诊断阳性(缺失为阳性)，反之则为阴性。

1.3 诊断效能评价指标 计算方法为：灵敏度=标志物真阳性数/(标志物真阳性数+标志物假阴性数)；特异性=标志物真阴性数/(标志物真阴性数+标志物假阳性数)；准确率=标志物真阳性数+标志物真阴性数/总病例数；Youden指数(灵敏度+特异性－100%)表示。

1.4 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行统计学处理。所有计量资料的实验数据经正态性检验，数据呈非正态分布，用中位数(四分位数间距)表示，各组之间比较用Mann Whitney U检验(非参数检验)。组间计数资料率比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组人群中 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA 的诊断阳性率比较 经测定后对原始数据进行统计分析，结果见表1，可见所测4类抗原在卵巢癌组和卵巢良性肿瘤组的诊断阳性率均显著高于对照组和卵巢良性肿瘤中有显著差异。其中CA-125在卵巢癌和良性肿瘤组中阳性率为各检测抗原中最高，敏感性最高。KiSS-1在血清中对卵巢癌组和卵巢良性肿瘤的诊断阳性率明显高于对照组 (P<0.05)，但与CA-125、CA-199标志物相比诊断阳性率相对较低，其敏感性与CEA相当。KiSS-1在卵巢癌中表达阳性率在良性卵巢癌肿瘤和卵巢癌中均有所下降。此外，可以发现在3例健康对照中，KiSS也出现诊断率阳性情况，即表达缺失。

表1 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA在各组受检人群中诊断阳性率结果比较

2.2 KiSS-1与 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌诊断中的灵敏度、特异度、准确性及Youden指数比较在卵巢癌组患者中，CA-125的敏感性最高为79.03%，高于其他标志物，其中KiSS-1较现有肿瘤标志物灵敏度低为48.39%。四类标志物特异性水平均较高，其中KiSS-1特异性达到79.55%，略低于CA-199和CEA。准确性CA-125最高为79.25%，CEA和KiSS-1对卵巢癌的诊断准确性比较接近。Youden指数由高到低依次为CA-125(54.03%)、CA199(44.72%)、CEA(35.70%)和 KiSS-1(27.94%)，KiSS-1 Youden指数水平较低。综合分析，CA-125和CA-199作为单个标志物在卵巢癌诊断中诊断性能较高；而KiSS-1与CEA诊断水平总体相当，或可成为诊断卵巢癌的一种新型指标。见表2。

2.3 KiSS-1联合 CA-125、CA-199、CEA 在卵巢癌诊断中的灵敏度、特异性、准确性及Youden指数的比较 CA-125作为卵巢上皮性腺癌的首先标记物，在本研究中也体现出对卵巢癌诊断的优势，因此作为联合诊断的必要标志物。KiSS-1联合CA-125及其他标志物时，灵敏度、特异性、准确性及Youden指数均随着指标组合增加而升高，表明联合检测的诊断效果更强。其中KiSS-1+CA125+CA199+CEA组合对卵巢癌诊断准确率高达91.25%。KiSS-1作为单个诊断因素时诊断效果显然低于CA-125等，但与其他肿瘤标志物联合检测时大大提升了原有组合(CA125+CA199+CEA)的诊断能力。联合检测时统 计 KiSS-1、KiSS-1+CA-125、KiSS-1+CA125+CA199、KiSS-1+CA125+CA199+CEA 及 CA125+CA199+CEA几组的实际数目来计算它们的灵敏度、特异性、准确性及Youden指数。联合检测时，只要任何一项是阳性即可总体判断为阳性；所有标志全为阴性则判断为总体阴性。见表3。

表2 KiSS-1与CA-125、CA-199、CEA在卵巢癌诊断中的灵敏度、特异性、准确性及Youden指数的比较(%)

表3 KiSS-1、CA-125、CA-199、CEA联合检测在卵巢癌诊断中的灵敏度、特异性、准确性及Youden指数的比较

3 讨论

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，发病率仅次于宫颈癌和子宫内膜癌，但病死率却超过两者之和，具有较高的病死率，主要原因是早期临床诊断困难及治疗后肿瘤易复发。卵巢癌早期无任何症状，较难发现，就医时多为中晚期，术后五年生存率低[13]。故而早期诊断对于临床诊疗意义重大。

目前卵巢癌早期只能通过血清肿瘤标志物等筛查，血清肿瘤标志物在临床肿瘤疾病的诊断、病情监测和预后判断等方面有着重要意义[14]。但由于肿瘤细胞生物学具有复杂和多样性的特性，相同类型的肿瘤可产生一种或多种肿瘤标志物，而不同肿瘤或同一肿瘤的不同组织类型既可以产生相同的肿瘤标志物，也可以产生不同的肿瘤标志物，所以绝大部分单一的肿瘤标志物检测的敏感性或特异性偏低，不能达到临床诊疗的需要，尤其是卵巢癌的早期诊断，血清CA-125在卵巢癌诊断中的特异性一直较好，但由于CA-125主要表达于浆液性卵巢癌，并且其水平高低与卵巢癌的临床分期密切相关，中、晚期卵巢癌患者血清中CA-125检测的水平和阳性率较高，而早期患者CA-125水平和阳性率不高[15]。因此，针对不同类型的肿瘤，组合不同的标志物进行多指标联合检测，对肿瘤的及早治疗极为重要。目前临床对卵巢癌诊断主要联合检测指标有CA-125、CA-199、CEA等，但诊断准确性有待提高，亟需新型标志物参与联合检测以提高诊断能力。本研究选用KiSS-1作为新型指标，并联合 CA125、CA199、CEA联合检测，探讨单个及联合检测模式在卵巢癌筛查和早期诊断中的临床价值。KiSS-1表达缺失常见于多种肿瘤中，如卵巢癌，但目前对KiSS-1作为癌症诊断标志物的研究则鲜有报道。本研究通过研究卵巢癌患者血清KiSS-1水平，并评价其诊断性能，判定其在早期卵巢癌诊断中的价值。结果发现KiSS-1单独检测时特异性和灵敏度均不是很高，与CEA诊断效果相当，但当其与CA125、CA199、CEA联合检测时则可以显著提高诊断准确性，这表明联合检测对于卵巢癌诊断优势明显，这与美国学者的研究结果相符[16]。当KiSS-1加入原有检测组合CA125+CA199+CEA时，可显著提升诊断准确性近10%，因而KiSS-1或可成为卵巢癌诊断的新型标志物。

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