基于NP968核酸提取仪 (磁珠法)的实时荧光定量PCR系统检测HBVDNA的性能评价

王建伟，孙嘉峰，黄毅

(1、福建省立医院南院福建省立金山医院检验科，福建 福州350008；2、福建省立医院检验科，福建 福州350001)

乙型肝炎病毒DNA(hepatitis B virus Deoxyribonucleic acid，HBV DNA)是反映HBV复制活跃程度及传染性的最直接指标，也是观察抗病毒药物疗效、预后和指导抗病毒药物应用的重要指标之一。HBVDNA定量检测从根本上突破了免疫学方法等间接方法的局限性，通过直接检测病毒核酸水平，可真实反应患者体内病毒水平[1-3]。目前提取HBVDNA主要采用煮沸法，该法不能有效去除干扰物质如血红蛋白，提取的血浆HBV DNA含量较低，接近临界值标本的提取结果不稳定，在临床检测中容易产生假阴性[4]。本研究应用西安天隆NP968自动核酸提取仪(磁珠法)提取HBVDNA，相比传统的煮沸法，具有快速、简便、减少人工误差等特点。根据ISO15189医学实验室认可标准[5]，必须对其检测系统进行性能评价，本文通过分析其精密度、线性、回收率、最低检出限，并将检测结果与传统煮沸法进行对比，分析其相关性，从而评价该法对HBVDNA检测的性能。

1 材料与方法

1.1 标本来源 来自2014年10月13日至10月17日我院PCR实验室接收的79例门诊患者血浆标本及我院免疫室接收的20份我院国内体检健康人血清标本。

1.2 仪器与试剂

1.2.1 试剂 HBVDNA荧光定量PCR检测试剂盒与HBVDNA标准品(广州达安公司)；核酸提取(磁珠法)试剂盒(西安天隆公司)。

1.2.2 仪器 NP968核酸提取仪(NP968，西安天隆公司)；ABI7300实时荧光PCR仪 (ABI7300,美国ABI公司)。

1.3 检测方法

1.3.1 HBVDNA提取与检测

1.3.1.1 煮沸法 按照达安公司HBVDNA荧光定量PCR检测试剂盒说明书取待测血浆样本、HBVDNA荧光定量PCR检测试剂盒内阳性对照品、阴性对照品、标准品和自制高值、低值质控品各30μl，分别加入70μl核酸提取液，充分振荡混匀后 ，100℃ 恒 温 处 理 10±1min，12000r/min 离 心5min，取 20μl上清液加入反应管，在 ABI7300实时荧光PCR仪上进行HBVDNA的定量检测。

1.3.1.2 磁珠法 按照NP968自动核酸提取仪 (磁珠法)试剂盒说明书，取待测血浆、达安试剂盒阳性对照品、阴性对照品、标准品和质控品各200μl，加入预先分装好自动核酸提取液的板孔内，放入NP968自动核酸提取仪内，按预定的提取程序自动执行核酸提取，最终得到100μl洗脱液，取20μl上清液加入反应管，在ABI7300实时荧光PCR仪上进行HBVDNA的定量检测。

1.3.2 精密度评价 按照CLSI EP15-A2标准：2个浓度水平，5d实验，每天一批，每批每个水平重复测定3次，所有测定数据均转化为对数值。

1.3.3 线性评价 选择1份高值患者血浆标本，浓度接近厂家试剂盒说明书给出的线性范围上限(5.00E8 IU/ml)，按1:10用正常人血浆倍比稀释此高值标本直至浓度接近线性范围下限 (1.00E2 IU/ml)，形成浓度由高到低7份待测实验样品。每份实验样品在检测系统上重复测定2次,结果转换为对数，取2次测定的均值作为实测值(Y)；以其系列稀释后理论上应含有的浓度(亦取对数)作为预期值(X)，将所有结果点在X-Y坐标图上，计算回归方程:Y=bX+a。

1.3.4 回收率 选择厂家配套低值标准品为基础样本，取180μl基础样本和20μl蒸馏水作为对照样本， 分别取 180μl基础样本和 20μl浓度为2.0E6IU/ml、2.0E5IU/ml和 2.0E4IU/ml的标准品作为回收样品。每份样品在检测系统上测定3次，结果转换为对数，取平均值。根据以下公式计算回收率：回收率=回收浓度/加入浓度×100%；回收浓度=最终测定浓度-基础样本浓度；加入浓度=标准品浓度×标准品体积/(标准品体积+基础样本体积)[6]。

1.3.5 最低检出限 依据YY/T 1182-2010中华人民共和国医药行业标准 《核酸扩增检测用试剂(盒)》之6.8.2条款要求[7]，采用无菌注射用水将购自卫生部临床检验中心的HBVDNA血清标准物质(1.20±0.24)E6 IU/ml按 1：10000 进行稀释，使其浓度达到广州达安公司HBVDNA试剂声明的最低检出限(1.00E2 IU/ml)后，进行25次重复检测，以至少22次结果≥1.00E2 IU/ml为最低检出限验证通过；如不符合此要求，应查找原因，并补充数据或重新实验。

1.3.6 参考区间 参考NCCLSC28-A2，通过测定29份我院国内体检健康人血清标本 (标本从我科免疫组获得，乙肝两对半模式为全阴/或-+---/或-+--+)的 HBV DNA 浓度，对〈1.00E3 IU/ml的生物参考区间进行验证；若20份标本的检测结果均在参考区间内或仅有2个标本超出，则验证通过。否则，进行参考区间确立实验。

1.3.7 相关性评价 分别采用煮沸法和磁珠法提取79例患者血浆标本进行荧光定量PCR，比较两种方法的相关性。

1.4 统计学方法 将定量HBVDNA拷贝数转化为对数值，所有统计学处理均在SPSS20.0统计软件包上进行。

2 结果

2.1 精密度验证 低、高水平样本检测的批内精密度均<3/5TEa，批间精密度均<4/5TEa。该检测方法的批内及批间精密度均符合厂家要求小于5%(见表1)。

表1 精密度验证结果

2.2 线性范围验证 HBV-DNA在4.16E2-4.16E8 IU/ml范围内具良好线性关系 (厂家线性范围1.0E2-5.0E8 IU/ml)，R2=0.989，b=1.01 在 0.97~1.03范围内；a=0.271，经t检验显示a与0无显著性差异(P>0.05)(见表 2，如图 1)。

表2 线性范围验证结果

图1线性验证数据散点图

2.3 回收实验 根据相关公式计算的检测平均回收率为104%。见表3。

2.4 最低检出限验证 厂家声明的最低检出限(1.00E2 IU/ml)验证试验通过。见表4。

2.5 参考区间 参考区间为<1.00E3 IU/ml。见表5。2.6两种方法检测结果的相关性分析 以煮沸法检测结果为X，以磁珠法检测结果为Y，经分析显示两者相关性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951。见图2。

表3 回收实验结果

表4 最低检出限验证实验结果

表5 参考区间验证结果

图2磁珠法与煮沸法检测结果相关性分析

3 讨论

我国人群对HBV普遍易感，HBVDNA是HBV感染最直接、特异性强和灵敏性高的指标。HBVDNA阳性提示HBV复制和有传染性，其含量越高表示病毒复制越厉害，传染性越强。因此，HBV DNA定量检测对于判断乙型肝炎传染性强弱、乙型肝炎病毒复制情况、乙型肝炎抗病毒治疗效果等都有十分重要的意义[8-11]。

病毒核酸的检测是生命科学领域一个重要的分支，在临床病原体检测、传染性疾病及基因诊断方面具有独特的应用价值。核酸提取是核酸检测中关键的步骤，直接影响后续实验结果[12]。目前，实验室一般采用传统的手工提取方法(煮沸法、柱提取法等)。煮沸法直接将病毒DNA从病毒颗粒中释放出来，离心后的上清液中不仅含有病毒核酸，还含有少量血红蛋白等一些干扰PCR的抑制性杂质；并且在处理临床标本时，存在生物安全等问题。因此，临床实验室迫切需要自动化方法来进行核酸提取[13]。随着纳米技术的发展，极大的推动了基于磁珠微球的自动核酸提取法的发展，目前自动核酸提取法(磁珠法)已经应用于临床核酸(DNA和RNA)等多种物质的分离和纯化[14]。磁珠法方法提取的核酸纯度高，能够除去大多干扰PCR的抑制因子，如蛋白质、多糖、酚类等物质，使实时荧光定量PCR检测方法更灵敏、更准确[15]。NP968自动核酸提取仪具有自身的优势：(1)提取速度快，操作时间短，30~60min/次，通量大，每次可同时提取32份样品；(2)内置紫外光杀菌功能可自我清洁；(3)严格控制孔间污染及批次间污染；(4)能有效避免人工操作引起的差异及错误，结果稳定，重复性好。

精密度评价实验按照EP15-A2文件进行，实验数据显示基于NP968自动核酸提取仪 (磁珠法)的实时荧光定量PCR系统，检测HBVDNA的低、高水平批内精密度均<3/5TEa，批间精密度均<4/5TEa，精密度良好。线性评价实验根据CLSI EP6-A文件，采用简便的平均斜率法，结果显示基于NP968自动核酸提取仪(磁珠法)的实时荧光定量PCR系统检测HBVDNA，在4.16E2~4.16E8 IU/ml范围内具有良好的线性关系，达到厂家的检测声明。最低检出限验证 依据YY/T 1182-2010中华人民共和国医药行业标准 《核酸扩增检测用试剂(盒)》之6.8.2条款要求，厂家声明的最低检出限(1.00E2 IU/ml)验证试验通过。在定量分析验证时，准确度通常可用回收率表示，回收率越接近100%表明分析方法准确度越高。本研究回收实验结果显示，基于磁珠法的HBVDNA检测回收率为104%，接近100%，准确度高。根据NCCLSC28-A2，参考区间<1.00E3IU/ml验证试验通过。此外，通过对79例患者血浆标本磁珠法与煮沸法HBVDNA检测结果的比较，表明两者相关性良好(Y=0.995X+0.526,R2=0.951)。总之，基于NP968自动核酸提取仪(磁珠法)的实时荧光定量PCR系统，实现了快速、自动化提取HBVDNA，对HBVDNA具有良好检测性能，适合临床实验室推广使用。

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