LZTFL1、Integrinβ1在肝细胞癌中的表达及意义

郑月娥，李里香

(1、江西卫生职业学院基础部，江西 南昌 330201；2、南昌大学第二附属医院病理科，江西 南昌 330006)

原发性肝癌90%以上是肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)。肝细胞癌是我国常见的恶性肿瘤之一。据最新统计，我国肝细胞癌年发病率和年死亡率均居恶性肿瘤的第二位，仅次于肺癌[1]。目前，治疗肝细胞癌公认的最有效方法是手术切除。但即使行根治性切除术，5年内仍有60%～70%的患者出现转移或复发[2]。肝细胞癌侵袭力强，早期即可发生侵袭与转移，这也是肝细胞癌死亡率高的主要原因。肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤的侵袭和转移是一个极其复杂的涉及多步骤多因素参与的主动过程。抑癌基因常能够在肿瘤侵袭与转移的关键步骤中发挥抑制作用[3]。LZTFL1是一种新发现的肿瘤抑制因子，在多种肿瘤组织中呈现低表达，且与肿瘤的转移显著相关，并发现LZTFL1能与细胞骨架Actin结合，能够成为黏附连接蛋白复合物(FAP)的一个组成部分[4]。而FAP是黏附分子Integrinβ1发挥作用的结构基础。近年，大量国内外的研究表明Integrinβ1的表达与肝癌的浸润转移及肿瘤的分化、分级、预后等密切相关，尤其在肝癌的浸润转移中发挥着关键性的作用[5-7]。两者在肝细胞癌中的表达及是否与肝癌患者临床病理特征有关，目前尚未见明确的报道。本研究采用免疫组织化学SP法检测肝细胞癌组织中LZTFL1和Integrinβ1的表达，探讨二者在肝细胞癌中表达的意义。

1 材料与方法

1.1研究对象及标本来源 收集90例HCC石蜡标本(男 75例，女15例)，年龄 24~74岁，平均 51岁。 其中高分化癌30例，中分化癌30例，低分化癌30例，均为2009年1月至2012年12月南昌大学第二附属医院经病理学确诊的外科手术标本，术前均未行放疗/化疗。20例正常肝组织标本来自本院因肝海绵状血管瘤手术的标本。

1.2 试剂与方法 兔抗人LZTFL1单克隆抗体(ab57395)购自美国Abcam公司，鼠抗人Integrinβ1单克隆抗体(D2E5)购自美国Cell Signaling公司，广谱二抗试剂盒、免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司。4μm连续切片，每例捞3张玻片，分别进行HE染色和LZTFL1、Integrinβ1免疫组织化学染色 (操作按照试剂盒说明书进行)。以PBS代替一抗作阴性对照。LZTFL1一抗稀释液浓度为1:100，Integrinβ1一抗稀释液浓度为1:80。组织抗原修复采用高温高压修复处理，抗原修复液为柠檬酸盐缓冲液。

1.3 结果判定 LZTFL1蛋白免疫组化结果以胞质中棕色颗粒沉积为阳性；Integrinβ1蛋白免疫组化结果以胞膜上棕色颗粒沉积为阳性。切片由两位观察者评判，连续计数 5个高倍视野，按照评分标准[8]，视野中肿瘤细胞中阳性细胞数所占百分率：无阳性细胞为 0分，≤10%为1分，11~50%为 2分，51~75%为3分，＞75%为4分；染色强度：肿瘤细胞无特异着色为0分，呈浅黄色为1分，呈棕黄色为2分，呈棕黑色为3分；以阳性细胞数得分与染色强度得分的乘积作为总评分。按照总评分将结果分为：0分为阴性(-)，1~4分为弱阳性(+)，4~8分为中等阳性(++)，9~12分为强阳性(+++)。在统计分析中以≤4分为低表达；＞4分为高表达。

1.4 统计学分析 免疫组化结果用χ2检验，相关性分析采用Spearman秩相关检验，取α=0.05为显著性检验水准，以P<0.05表示差异有统计学意义。(采用SPSS19.0统计学软件)。

2 结果

2.1 LZTFL1、Integrinβ1蛋白在肝细胞癌组织及正常肝组织中的表达 LZTFL1在正常肝组织细胞胞浆大多呈棕褐色着色，表达呈强阳性；肝细胞癌组织细胞胞浆多呈淡黄色着色，表达呈弱阳性；与正常肝组织相比，肝细胞癌组织中LZTFL1阳性率明显降低，差异有统计学意义(P＜0.001)。而Integrinβ1在正常肝组织细胞胞膜多数无特异性着色，肝细胞癌组织细胞胞膜多呈淡黄色或棕色着色；与正常肝组织相比，肝细胞癌组织中Integrinβ1阳性率明显升高，差异有统计学意义(P＜0.001)。见表1、图1。

表1 LZTFL1、Integrinβ1在正常肝组织及肝癌组织中的表达情况(n，%)

图1 LZTFL1、Integrinβ1蛋白在正常肝组织和HCC组织中的免疫组化SP染色 ×200

2.2 LZTFL1、Integrinβ1蛋白表达与 HCC临床病理学特征参数的关系 LZTFL1的阳性表达率随着肝细胞癌组织分化程度的降低而逐渐下降，表达强度高分化组显著高于中分化组和低分化组，差异有统计学意义(P＜0.05)。Integrinβ1的阳性表达率随着肝细胞癌组织的分化程度的降低逐渐升高，表达强度高分化组显著低于低分化组，差异有统计学意义(P=0.022＜0.05)。此外，二者的表达与患者的年龄、性别无显著相关性(P＞0.05)。分别见表2、表 3。

2.3 LZTFL1和Integrinβ1表达的相关性 HCC组织中 LZTFL1和 Integrinβ1呈现负性相关 (r=-0.406，P=0.026＜0.05)。 见表 4。

表2 HCC中LZTFL1的表达强度与临床病理学特征参数的关系

表3 HCC中Integrinβ1的表达强度与临床病理学特征参数的关系

表4 HCC中LZTFL1和Integrinβ1表达强度的相关性分析

3 讨论

LZTFL1(Leucine Zipper Transcription Factor Like 1)是一种新发现的肿瘤抑制因子[4]，位于人类3号染色体短臂2区1带第3亚带(3p21.3)末端卢卡区约5Mb处。2001年Kiss[9]等人在对人类染色体3p21.3的C3CER1区域进行基因组测序中首次发现并克隆了LZTFL1基因。2010年，魏群[4]等对组织芯片及84例胃癌患者进行了研究，这一研究首次证实了LZTFL1是肿瘤抑制因子，在多种肿瘤组织中低表达，且与肿瘤的转移显著相关。并发现LZTFL1能与细胞骨架Actin结合[4]，能够成为黏附连接蛋白复合物(FAP)的一个组成部分。随后，国外学者Sakurai T[10]等对SAMP8老鼠的实验研究表明LZTFL1能促进中枢神经细胞神经轴突的生长，可能参与了运动锻炼对海马区认知损害的预防作用。Seo S[11]等发现LZTFL1是巴-比二氏综合征蛋白复合物睫毛运输作用及Hedgehog信号的重要调节因子，且Marion V[12]等进一步研究证实LZTFL1是一种新的巴-比二氏综合征相关基因。

Integrinβ1是构成细胞与细胞、及细胞与细胞外基质间不可缺少的黏附因子。FAP是整合素信号传导的结构基础[13]。FAP的形成和焦点粘着斑激酶(FAK)的激活使整合素可通过多种特异的信号转导途径参与肿瘤细胞的浸润转移[14-16]。大量国内外的研究表明Integrinβ1的表达与肝癌的浸润转移及肿瘤的分化、分级、预后等密切相关。由于正常成人肝细胞不存在基膜，所以肝细胞中整合素的表达与其他上皮细胞有所不同，仅能低水平的表达几种整合素；当细胞癌变时，整合素受体随之发生改变，其中表达明显升高的整合素中以β1亚基的作用最为重要[5]。Integrinβ1不仅是介导细胞与细胞外基质的主要的黏附分子，也是肿瘤细胞与血管内皮细胞间黏附的主要的黏附分子。在肝癌细胞的黏附转移中整合素介导的信号转导起着非常重要的作用。Musumoto[6]等研究发现，肝癌的侵袭性可被Integrinβ1的单克隆抗体TS2/16所抑制，Integrin β1与肝癌的侵袭潜能相关；同时，郭悦青[7]等研究也表明肝癌组织内Integrinβ1的表达明显高于非肝癌组织，且在肝癌中Integrinβ1的表达可作为判断肝癌侵袭性的一项指标。因此，Integrinβ1的表达在肝癌的浸润转移中发挥着关键性的作用。

为了进一步研究LZTFL1的生物学功能，我们用免疫组织化学SP法联合检测了90例HCC组织及20例正常组织中LZTFL1及Integrinβ1的蛋白表达，发现与正常肝组织相比，HCC组织中LZTFL1的表达显著降低，随着HCC分化程度的降低，LZTFL1阳性表达率逐渐下降，且中、低分化组中LZTFL1阳性表达率显著低于高分化组；而In-Integrinβ1在HCC组织中的表达明显升高，并随着分化程度的降低，Integrinβ1的表达呈上升趋势，低分化组明显高于与高分化组的表达强度；差异均具有统计学意义(P＜0.05)。二者在不同年龄和性别的HCC患者中的表达均无显著性差异。我们的实验结果表明LZTFL1表达的降低及Integrinβ1表达的升高与HCC的侵袭和转移密切相关，提示LZTFL1高表达可能能够抑制肝细胞癌的侵袭转移。我们的研究结果还发现90例HCC组织中LZTFL1和Integrinβ1的蛋白表达呈负性相关(r=-0.406，P=0.026＜0.05)。 提示 LZTFL1 可能通过结合细胞骨架Actin作为细胞外基质-整合素-细胞骨架黏附物的一个组成部分，调控Integrinβ1，参与肿瘤细胞的侵袭和转移。

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