玉米交换单株高效筛选体系的研究

温晶晶，高景阳，王永霞，赵荣兵，丁俊强，吴建宇

(1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002;2.河南农业大学农学院，河南郑州450002)

利用分子标记对QTL进行精细定位，需要提取大量单株的基因组DNA进行交换单株的筛选［1，2］。因此，建立快速有效的 DNA 提取和相应的PCR扩增、检测程序十分必要。CTAB法［3］和SDS法［4］是2种经典有效的提取高质量基因组DNA的方法，但其步骤复杂、耗时;虽然有许多学者对这2种方法进行了改进［5－7］，但仍然离不开液氮、人工研磨、用β-巯基乙醇和水浴进行抽提、离心沉淀等程序，并且 DNA的检测时间长、费工费时［8］，难以适用于图位克隆目标基因时提取大群体基因组DNA并进行检测的要求。在拟南芥、烟草、高粱、棉花、苔藓和松针上，XIN 等［9］报道一种不需要酚、氯仿、CTAB和SDS，也不需要离心抽提的快速DNA提取方法，可以高效地进行DNA提取和PCR检测。基于快速高效筛选交换单株的目的，根据其提取方法和PCR扩增方法，用玉米叶片进行尝试。在抗病目标区域筛选合适引物的基础上，探索优化PCR体系中的DNA模板量和引物浓度，并比较保护剂对PCR反应的影响，最后结合双重PCR［10－14］技术，建立大群体提取基因组 DNA 以及交换单株筛选的高效体系，可以缩短试验周期，提高研究效率。

1 材料与方法

1.1 试验材料

抗病自交系四一和感病自交系Mo17及其经过多代回交得到的近等基因系群体，取自河南农业大学科教园区。

1.2 DNA 提取

参考适用于PCR的高通量DNA提取方法［9］，利用玉米叶片对大量提取DNA的流程加入缓冲液(Buffer A，Buffer B)进行优化。

DNA提取液成分:Buffer A:由100 mmol·L－1NaOH，2%Tween®20 组成;Buffer B:pH 为2.0，由100 mmol·L－1Tris-HCl，2 mmol·L－1EDTA 组成，分别在5片叶和10片叶时提取基因组DNA。

DNA提取步骤:冰上操作，用镊子取少量玉米叶片(约30 mm2)放入96孔PCR板中，加入50 μL Buffer A，PCR仪上95℃ 孵育10 min，加入50 μL Buffer B轻柔混匀，配20 μL的 PCR反应体系，DNA稀释5倍后加1 μL。

1.3 引物设计

通过NCBI数据库查找到B73参考图谱上的SSR标记和InDel标记及玉米抗性遗传育种课题组开发的BAC－SSR标记，送往深圳华大基因科技有限公司合成。

1.4 检测方法

1.4.1 DNA检测 用1.0% 的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，电泳检测结果在凝胶成像系统中观察并成像。

1.4.2 PCR 产物检测

1.4.2.1 双重PCR反应体系 基于高通量DNA提取［9］时 PCR反应体系加入保护剂 PVP-40和BSA的设想，反应体系设计为总体积20 μL，包括国产商品化的2x Taq MasterMix(含染料)10 μL，引物1(10 μmol·L－1)1 μL，引物2(10 μmol·L－1)1 μL，PVP －40(67 g·L－1)3 μL，BSA(20 g·L－1)1 μL，DNA 1 μL，ddH2O 3 μL。反应液混合后，用 20 μL石蜡油覆盖，以免反应液蒸发。

1.4.2.2 双重PCR反应程序 双重PCR反应程序为:94℃ 预变性3 min，94℃变性30 s，60℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共35个循环;72℃ 延伸10 min，待温度降至4℃ 时取出，扩增产物用质量分数为6.0%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并银染［15］。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

取约30 mm2的玉米叶片(5叶)加入Buffer A、Buffer B煮叶片提取基因组DNA，并用1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测(图1)。从图中可以看出提取的DNA质量浓度较高，有可见的DNA主条带，满足PCR分析的需要。

图1 煮叶片提取的DNAFig.1 DNA quality extracted using alkaline lysis method

2.2 PCR扩增及电泳检测

2.2.1 引物筛选 设计了48对分子标记，从中筛选出20对在亲本四一和Mo17间存在多态性的引物，利用近等基因系 Mo17AA/BB和 Mo17aa/BB(字母AA指的是第3染色体上Rscmv2的基因型，右侧字母BB指的是第6染色体上Rscmv1的基因型［16］)筛选到5对在抗病目标区间存在多态性(表1)。引物筛选所用的DNA模板由实验室改良的SDS法提取，PCR反应体系和程序采用实验室筛选分子标记通用体系和程序。

2.2.2 DNA模板量 在PCR反应体系中，加入过多煮叶片提取的DNA溶液会带入过量的杂质，抑制PCR反应，因此需要对模板DNA加入量进一步研究。从5对多态性引物中挑取1对引物P3对DNA模板量进行检测，其中DNA质量浓度(原液、原液稀释5倍、原液稀释10倍)是主处理，幼苗(5叶)和大苗(10叶)是副处理，以反应体系中的模板量(1、2、3 μL)进行 PCR 反应，亲本为对照(图2)。得出质量浓度为 136.5 ng·μL－1的 DNA 原液作模板加1、2、3 μL时，2种叶龄处理均无条带;原液稀释5倍，模板加1、2、3 μL时，2种叶龄处理均有条带;原液稀释10倍时，大苗无带，幼苗模板加1、2 μL 有条带，加 3 μL 带很弱(表 2)。可见，DNA质量浓度不可过大，原液稀释5倍时PCR结果较稳定，且幼嫩叶片较好(5叶)。因此，选用DNA原液稀释5倍时DNA模板加1 μL，用于后续的引物条件探索和PCR反应体系中加保护剂及双重PCR的试验。

表1 在近等基因系间有多态性的引物Table 1 The primers exhibited polymorphisms between the NILs

图2 DNA模板量不同梯度的PCR扩增结果Fig.2 The PCR amplification results of different gradient of DNA template

表2 DNA质量浓度梯度结果分析Table 2 The analysis results of DNA concentration gradient

2.2.3 引物浓度 基于引物浓度是否影响PCR反应的实验目的，对浓度为10 μmol·L－1的引物在体系中分别加入1 μL 和 2 μL，配 20 μL 的 PCR体系。用煮叶片提取的DNA原液稀释5倍后加1 μL作模板，选择上述引物P3，体系中加入保护剂PVP-40和 BSA，1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。可见，现提取的DNA(图3-B)与其4℃保存7 d后(图3-A)不影响PCR结果检测;引物加2 μL的条带较1 μL亮，但引物二聚体的含量也相应增加，为此选用引物加1 μL用于后续试验，既满足试验要求又经济;此外，图3与图2对比，可以看出加入保护剂后可明显提高PCR效率。

图3 不同引物质量浓度梯度的PCR扩增结果Fig.3 The PCR amplification results of different concentration gradient of the primer

2.2.4 双重PCR 为了提高筛选交换单株的效率，把煮叶片提取DNA的方法与多重PCR技术结合，可以大大减少试验工作量，提高交换单株的检测效率。在抗病目标区间存在多态性的5对引物，其中1对 (P5)和另外4对 (P1、P2、P3、P4)分别位于抗病目标区域的两端，组合引物进行双重PCR扩增，并用6.0% 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测(图4)。可以看出引物组合P5－P2和P5－P3扩增效果最好，可以同时读带，选择其中1对可用于交换单株的筛选(反应体系中加入了保护剂PVP－40和BSA)。

图4 双重PCR检测结果Fig.4 The results of the double PCR

3 结论与讨论

本研究在进行玉米矮花叶病抗病基因Rscmv2精细定位时，抗病目标片段两端的标记距离很近，交换单株出现的概率大大降低，需要种植大群体(包括2万个单株)用于交换单株的筛选。这个工作若在玉米吐丝抽雄前完成，只需要对交换单株套袋并自交授粉，可大大减少授粉的工作量，加快试验进程。根据XIN等［9］报道的一种适用于PCR的快速提取DNA方法并结合多重PCR技术，在玉米幼嫩叶片上进行了尝试，并与改良碱煮法［17］作了比较，发现前者PCR检测结果较好。

这种提取基因组DNA的方法简单、快捷、经济，省去了传统提取方法冗杂的过程，但是如多糖、蛋白质、叶绿素等细胞内含物均存在于DNA溶液中［18］，这些杂质过多会抑制Taq酶活性，进而影响后续的PCR反应。为了解决这一问题，在DNA质量浓度、引物浓度、PCR反应体系这3个方面作了进一步探索，并取得了较好的结果。首先，设置DNA质量浓度梯度将原液改进为稀释5倍后加1 μL，且用幼嫩的玉米叶片，如5叶较好。其次，对引物浓度加以检测，发现在一定范围内引物浓度对PCR的影响不大，但在PCR体系中加入保护剂PVP-40和BSA会大大提高扩增效率。最后，为了提高交换单株的检测效率，依据多重PCR技术，在扩增体系中同时加入2对引物，通过引物组合试验，得到扩增效果非常好的引物组合，不仅降低了成本，还提高了研究效率。

本研究通过把煮叶片提取DNA的方法与多重PCR技术结合，实现了快速鉴定交换单株的目的。1人提取100个样品只需30 min左右，提取之后即可进行PCR检测，也可以4℃ 保存5～7 d，操作简单，快捷。另外，双重PCR的检测不仅节省了时间，加快了试验进程，而且降低了成本。利用这个体系，已经拿到玉米矮花叶病成株期特异抗性基因Rscmv2的候选基因［16］。这种方法不仅适用于分子标记定位研究，还适用于玉米遗传多样性研究，分子标记辅助选择和转基因后代研究。

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