生物合成量子点在化学生物学实验教学中的应用

崔 然

(武汉大学 化学与分子科学学院, 生物医学分析化学教育部重点实验室, 湖北 武汉 430072)

生物合成量子点在化学生物学实验教学中的应用

崔 然

(武汉大学 化学与分子科学学院, 生物医学分析化学教育部重点实验室, 湖北 武汉 430072)

如何通过生物体系来解决化学难题是化学生物学的新领域之一。活细胞合成CdSe量子点是利用活酵母细胞作为反应器,通过调控细胞的生长周期来耦合细胞内不相关的两条生化反应途径,使其在活酵母细胞内发生反应,通过将传统的CdSe量子点合成方法中涉及到的繁琐危险的化学操作演变为仅仅‘喂养’细胞,即可获得闪闪发光的CdSe量子点。该方法成功地建立了一个通过生物体系来解决化学难题的范例,并且实验方法温和安全,实验结果具有展示性,适合于课堂教学。

活酵母细胞; 化学生物学; 量子点

化学生物学是现代化学与生物化学在深层面交叉的学科,诞生于上世纪九十年代。世界上一些著名的大学如美国哈佛大学和康奈尔大学等都设立了化学生物学系,著名的美国Scripps研究所也于二十世纪九十年代中叶成立了化学生物学研究所。国内一些大学和研究机构也分别设立了化学生物学研究中心、重点实验室、化学生物学系和化学生物学专业[1],武汉大学也是较早设立化学生物学专业的学校之一。但是到目前为止,化学生物学仍然是一个新的、定义不太明确的领域[2-3]。

对于化学生物学这样一门新兴专业的课程教学,尤其是其相应的实验课程的教学,不像其他学科的实验教学有成熟的体系。另外,生命系统的复杂性决定了生命本质的研究是一个极其漫长的过程,这就决定了化学生物学这门学科是一个不断推陈出新的前沿性的学科。并且化学以及生物学都是以实验为基础的学科,如何通过实验教学向学生展示前沿的化学生物学的研究进展成为了一个紧迫而艰巨的任务。

量子点(quantum dot,即半径小于或接近激子玻尔半径的半导体纳米晶粒)[4]作为一类性能优良的荧光标记纳米材料,在生物医学领域应用的突出优势和巨大潜力[4-7],已经得到国际上的高度认可。活细胞合成量子点是纳米材料的研究领域中具有我国原创性的研究。通过对活酵母细胞的培养条件的控制,就可以在显微镜下直观地看到细胞自身合成的闪闪发光的量子点[8]。该研究将繁琐危险的化学操作演变为仅仅培养细胞,既可以培养学生在生物实验方面的动手能力,又可以向学生展示出化学领域在纳米材料方面的最新进展,因此非常适合作为学生实验。目前,我们在已有的研究工作的基础上,已经将部分研究成果简化为一个简便、易行的化学生物学本科教学实验,并收到了良好的效果。

1 活酵母细胞合成量子点的实验原理

传统的CdSe量子点的合成通常采用金属化合物/元素有机物路线,其合成通常都采用易燃易爆有毒的有机试剂,并且需要在无水无氧的300 ℃的高温下进行[7-10],合成需要的条件苛刻,操作方法难以控制。这种传统的化学合成方法无论对环境还是操作者都有很大的潜在的危险。

本文尝试通过生物与化学的交叉来解决化学领域内这些棘手的问题。众所周知,在生物体内存在着各种高效、专一、温和的酶促生化反应,虽然发生在活细胞中的这些生化反应十分复杂,但是其指导原理在所有生物中都是相通的。如果能够针对生化反应的特点有目的地对其加以调节和控制,甚至对多个不同反应途径进行调控,就能够将这些高效的生化反应体系引入到化学合成领域中,实现我们所期望的、原本不可能发生的反应。

酵母细胞是具有清楚研究背景的模式生物[11-12],是合成荧光纳米材料CdSe量子点的理想的候选生物。酿酒酵母(eukaryoticSaccharomycescerevisiae)是一个非常精密的微小的真核细胞,在其体内有成千上万个生化反应精确地调控着细胞自身的各种代谢过程[13-14]。它可以通过自身错综复杂的调控体系对环境中各种各样的变化产生快速精准的反应13。因此这样的一种生物体不仅仅是基础科研的一个良好的平台,更是生物工程和生命科学当中的一个有力的工具[12,14]。

正是由于酵母细胞内这些精密的生化反应,使得其在特定的条件下,可以分别通过对Na2SeO3的代谢产生带有—SeH基团的有机硒[15]以及对CdCl2的解毒形成稳定的[Cd·(GS)2]2+[16],得到的这些物质恰好是合成CdSe量子点的原料。但是这两条代谢途径在正常的酵母细胞内是互不相关的,只有通过控制酵母细胞的培养时间,使酵母细胞在发生Se代谢的同时发生CdCl2的解毒,从而在酵母细胞内同时产生合成CdSe量子点的原料,随后通过控制酵母细胞的培养条件和培养时间,最终成功地在30 ℃下细胞内合成出来多种荧光颜色的CdSe量子点,避免了高温(300 ℃)或高压，以及所有易燃、易爆、有毒的有机试剂。活酵母细胞合成CdSe量子点原理示意见图1。

图1 活酵母细胞合成CdSe量子点原理示意图

2 活酵母细胞合成CdSe量子点技术在化学生物学实验教学中的应用

活酵母细胞合成CdSe量子点技术在化学生物学实验教学的应用,具体来说需要从以下几个方面进行。

(1) 实验目的：①了解酵母细胞合成CdSe量子点的原理；②掌握酵母细胞的培养；③掌握酵母细胞合成CdSe量子点技术；(4)学习酵母细胞合成CdSe量子点的表征。

(2) 实验药品及仪器：蛋白胨、葡萄糖、酵母提取物、水、0.1 mol/L的氢氧化钠溶液、0.1 mol/L的Na2SeO3溶液、0.1 mol/LCdCl2溶液、超纯水；无菌操作台、高压蒸汽灭菌锅、分析天平、超声仪、无菌操作箱、摇床、离心机、倒置荧光显微镜。

3 实验步骤

(1) YPD培养基的配制。在无菌操作台(见图2)中进行以下操作：先在烧杯中放入一半水量,然后按配方比例分别准确称取葡萄糖、蛋白胨、酵母提取物(葡萄糖20 g,蛋白胨20 g,酵母提取物10 g,水1000 mL),依次放入烧杯中,用玻璃棒搅拌使溶化后,补充水分到所需的总体积；随后用0.1 mol/L氢氧化钠调节培养基的pH,直至pH值在7.2～7.6之间；将配好的培养基分装到锥形瓶中,锥形瓶中液体培养基体积应为1/5左右。锥形瓶口用专用封口膜封口,防止污染,同时保证有良好的通气性能。三角烧瓶的封口膜外包一层牛皮纸,以防止灭菌时冷凝水润湿封口膜。注明培养基名称、配制日期等。培养基分装好后立即用高压蒸气灭菌(0.56 kg/cm2,112.6 ℃,30 min),以防止杂菌生长。

图2 无菌操作台

(2) 活酵母细胞合成CdSe量子点。

① 酵母细胞培养至生长曲线的稳定期。在无菌操作台内的酒精灯附近,左手托住已培养出单菌落的酵母平板,用拇指和食指将平板打开一定角度,用无菌竹签从中挑取一个单菌落,放入20 mL的YPD培养基中,轻轻混匀,注意避免竹签碰在烧瓶瓶口,封上封口膜,盖好平板；将加有酵母单菌落的20 mL的YPD培养基放入摇床中,在30 ℃、170 r/min培养24 h至酵母细胞生长稳定期。

② 酵母细胞的硒化培养。在无菌操作台中将生长至稳定期的酵母细胞用移液枪吸取1%(200 μL)移至20 mL新鲜的YPD培养基中,共取4份,封上封口膜,做好标记；将此新鲜的YPD培养基放入摇床中,在30 ℃、170 r/min培养24 h； 向其中2份分别加入0.1 mol/L的Na2SeO3溶液(终浓度为5 mmol/L),封上封口膜,放入摇床中,在30 ℃、170 r/min培养24 h,分别标记为1号和2号。另外2份不加0.1 mol/L的Na2SeO3溶液,继续放在摇床中,分别标记为3号和4号。将此4管放入摇床,在30 ℃、170 r/min培养24 h。

③ 酵母细胞合成CdSe量子点。将步骤②中4份酵母细胞分别转入无菌离心管中,在转速为2 000r/min的离心机中离心5 min,取出,倾去上清液后,将收集离心得到的酵母分别转入4份20 mL新鲜的YPD培养基中,标记为对应的记号；在1号和3号新鲜的YPD培养基中加入0.1 mol/L的CdCl2溶液(终浓度为1 mmol/L),2号和4号不加CdCl2溶液,封上封口膜；放入摇床中,在30℃、170 r/min培养24 h。1号为样品,2号—4号为对照。

(3) 酵母细胞合成的CdSe量子点的表征。将培养的4管细胞在转速为2000 r/min的离心机中离心5 min,取出,倾去上层培养基；取3 mL、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液加入离心管中,重悬后,在同样条件下离心洗涤,重复3次；将洗干净的酵母用3 mL、pH为8.0的Tris-HCl缓冲液重悬；从样品中取5 μL细胞悬浮液滴于载玻片上,盖上盖玻片制样；在倒置荧光显微镜下用100×油镜进行观察，将倒置荧光显微镜的汞灯强度调到最强,并将物镜下的光圈调至UV,观察酵母细胞的荧光(见图3)。比较合成了CdSe量子点的酵母细胞与对照酵母细胞的荧光区别。

图3 合成CdSe量子点后酵母细胞的荧光显微镜图片

4 教学建议

(1) 本实验需要的时间周期为4 d,因此需要给学生较长的时间来学习。建议将本实验作为学生的设计实验。

(2) 在进行本实验前,要求学生查阅《微生物学实验》,学习微生物培养的基本操作和知识。

(3) 实验完成后进行课堂讨论与总结,集体讨论以下2个问题:①为什么最终得到样品中的酵母细胞与对照的酵母细胞的荧光有区别,其区别说明了什么？②酵母细胞为什么要培养至生长曲线的稳定期？指导教师可借此机会向学生介绍微生物生长的特性以及CdSe荧光量子点的特性。

5 结束语

实践表明,活酵母细胞合成CdSe量子点实验具有生动、效果直观、便于操作等优点,既有利于学生理解和掌握微生物生长的特性等生物学方面的知识,也有利于学生掌握荧光纳米材料的特性等化学方面的前沿动态,同时也有利于激发学生的学习积极性以及创新精神。

References)

[1] 张臣.浅析化学生物学复合型人才培养[J].华南师范大学学报:自然科学版,2010(增刊1):52-54.

[2] 王世敏,宋功武,李玲.化学生物学的科学内涵及其发展[J].湖北化工,2002(4):1-3.

[3] 吴厚铭.化学生物学：新兴的交叉前沿学科领域[J].化学进展,2000,12(4):423-430.

[4] Alivisatos A P.Perspectives on the physical chemistry of semiconductor nanocrystals[J].J Phy Chem，1996,100(31),13226-13239.

[5] Chan W C,Nie S.Quantum dot bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science，1998,281：2016-2018.

[6] Jr Bruchez M,Moronne M,Gin P,et al.Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels[J].Science， 1998,281：2013-2016.

[7] Murray C B,Norris D J,Bawendi M G.Synthesis and characterization of nearly monodisperse CdE(E = S,Se,Te) semiconductor nanocrystallites[J]. J Am Chem Soc， 1993,115(19)：8706-8715.

[8] Cui R,Liu H H,Xie H Y, et al. Living yeast cells as a controllable biosynthesizer for fluorescent quantum dots[J]. Adv Funct Mater，2009,19：2359-2364.

[9] Qu Lianhua,Peng Z A,Peng Xiaogang.Alternative routes toward high quality CdSe nanocrystals[J]. Nano Lett，2001,1(6)：333-337.

[10] Qu Lianhua, Peng Xiaogang. Control of photoluminescence properties of CdSe nanocrystals in growth[J]. J Am Chem Soc, 2002,124(9)：2049-2055.

[11] Simon J A,Bedalov A.Yeast as a model system for anticancer drug discovery[J].Nat Rev Cancer,2004,4：481-487.

[12] Botstein D,Chervitz S A,Cherry J M.Yeast as a model organism[J]. Science， 1997,277：1259-1260.

[13] Gray J V, Petsko G A, Johnston G C, et al.“Sleeping beauty”:Quiescence in Saccharomyces cerevisiae[J].Microbiol Mol Biol Rev， 2004,68,(2)：187-206.

[14] Ross-Macdonald P,Coelho P S ,Roemer T,et al.Large-scale analysis of the yeast genome by transposon tagging and gene disruption[J]. Nature，1999,402：413-418

[15] Kessi J,Hanselmann K W.Similarities between the abiotic reduction of selenite with glutathione and the dissimilatory reaction mediated by Rhodospirillum rubrum and Escherichia coli[J].J Biol Chem， 2004,279,(49)：50662-50669.

[16] Li Z S,Lu Y P,Zhen R G,et al.A new Pathway for vacuolar cadmium sequestration in Saccharomyces cerevisiae:YCF1-catalyzed transport of bis(glutathionato)cadmium[J].Proc Natl Acad Sci U S A， 1997,94：42-47.

Application of quantum dots biosynthesis technology in teaching of chemical biology experiments

Cui Ran

(Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine(Ministry of Education),College of Chemistry and Molecular Sciences, Wuhan University,Wuhan 430072, China)

Utilizing biosystems to solve the problems of chemistry is one of the new courses in chemical biology.By contriving to couple unrelated intracellular biochemical reactions in an appropriate space and time sequence,the controllable biosythesis of fluorescent CdSe QDs at mild condition has been realized just by incubating yeast cells at 30°C.This strategy is a good example of how the biological systems can address some of the problems associated with traditional methods of chemical synthesis.This controllable and mild strategy is suitable for the chemical biology teaching.

living yeast cells; chemical biology; quantum dots

2014- 12- 08

国家自然科学基金青年科学基金项目“以活细胞为平台可控制备生物检测标记纳米材料”(21105075);中国博士后科学基金特别资助项目“调控生化反应制备面向活体成像的近红外纳米生物探针”(2012T50663)

崔然(1981—),女,河南焦作,博士,讲师,研究方向为纳米生物医学分析.

E-mail：cuiran@whu.edu.cn

Q-33

B

1002-4956(2015)7- 0071- 04