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虎掌南星组织培养的初步研究

2015-05-08昀,韩

商丘职业技术学院学报 2015年2期
关键词:南星商丘外植体

逯 昀,韩 霜

(1.商丘职业技术学院,河南 商丘 476000; 2.商丘师范学院 生命科学学院,河南 商丘 476000)

虎掌南星组织培养的初步研究

逯 昀1,韩 霜2

(1.商丘职业技术学院,河南 商丘 476000; 2.商丘师范学院 生命科学学院,河南 商丘 476000)

以虎掌南星(Rhizoma Pinelliae PedatisECTae),的块茎为试验材料,用不同消毒处理对虎掌南星外植体进行灭菌,并进行愈伤组织及丛生芽产生的初步研究. 结果表明:虎掌南星外植体洗刷干净后使用75%乙醇溶液灭菌30s,后再用0.1%HgCl2消毒15min,每次消毒后用无菌水清洗5遍,每遍3min. 这种处理方法污染率较低. 无论从平均愈伤组织诱导率还是从愈伤组织的质量上看,虎掌南星愈伤组织在MS上诱导优于B5.

虎掌南星;灭菌方法;培养基

虎掌南星为天南星科植物虎掌PinelliapedatisECTaSchott的块茎. 别名:掌叶半夏、天南星、麻芋果. 古代本草有关虎掌性味功能的记载如《神农本草经》:“虎掌味苦温;主心痛,寒热结气,积聚伏梁,伤筋痿拘缓,利水道”;《吴普本草》:“神农雷公无毒,岐伯桐君辛有毒”;《名医别录》:“虎掌微寒,有大毒”. 不过,它的扁球形块茎却是一味中药,有祛痰、消肿毒的功效. 主治中风、半身不遂、癫痫、惊风、破伤风、跌打损伤或虫蚁咬伤等病症[1]66-72,[2]45,[3]49-51. 虎掌南星自然繁殖率很低,由于其极高的药用价值,近几年野生资源受到了无节制地采挖,已近枯竭.目前虎掌南星的组织培养快繁研究仍未取得很圆满的结果[2]45. 本文通过虎掌南星组织培养研究以期达到虎掌南星资源可持续利用的目的.

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虎掌南星来自安徽砀山、河南南阳. 外植体为块茎、茎段、叶片以及果实.

1.2 材料消毒

虎掌南星外植体用洗衣粉洗净后,再用洗衣粉水浸泡30 min,流水冲30 min,无菌水冲洗2遍,75%酒精浸泡30 s,无菌水冲洗3~4遍待用.

1.3 培养条件

本实验选用MS为基本培养基,生长调节剂选用BA4.0 mg/l+2,4-D 0.5 mg/L的混合性,全光照24 h培养,温度为20 ℃.

1.4 试验方法

1.4.1 不同消毒方法灭菌效果的影响

将已消毒好的块茎在超净工作台上先用75%乙醇浸泡30 s,无菌水清洗3~4遍,每遍3 min;再用0.1% HgCl2消毒. 试验设计2种处理,每次消毒后用无菌水清洗5遍,每遍3 min,后用滤纸吸干表面水分并将块茎切口端剪去一部分后接入培养基中. 每瓶培养基中接种3个外植体,每种处理共接种45个外植体,每种处理重复两组[4]6-7,[5]62-64,[6]259-261. 具体设计见表1.

表1 0.1%氯化汞不同消毒时间设计方案

不定期地对外植体的污染和无菌外植体的存活动态进行观察记录,接种45 d后统计外植体的污染率和无菌外植体的存活率.

污染率%=(污染外植体数/总外植体数)×100%

存活率%=(成活外植体数/总外植体数)×100%

1.4.2 不同部位对愈伤组织诱导的影响

选取虎掌南星块茎、茎段、叶片以及果实4部分,接种于MS+6-BA 4 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L的培养基中. 确定植株4个不同部位对愈伤组织诱导的影响,每个处理接种15个外植体,重复3次.

1.4.3 数据统计分析方法

1.4.3.1 愈伤组织诱导

诱导愈伤组织试验中,每隔3 d观测一次,观察期为45 d. 统计愈伤组织诱导率和愈伤组织发生时间[7]59-61.

愈伤组织诱导率=(产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数)×100%

愈伤组织发生时间=达到最终愈伤诱导率1/2的天数

1.4.3.2 不定芽诱导

芽诱导期间,每隔5 d进行一次观察,观察期为60 d. 统计诱导出芽的愈伤组织数(以高度大于0.2 cm的不定芽为有效芽),计算每个处理的芽诱导率及诱导时间.

芽诱导率=(诱导出芽的愈伤组织数/接种愈伤组织数)×100%

芽诱导时间=达到最终芽诱导率1/2时的天数

平均每块愈伤组织出芽数=诱导出的芽数/产生芽的愈伤组织数

1.4.3.3 生根培养

生根培养过程中,以根长达到0.5 cm的根为有效根,统计每个处理平均生根率、每株苗平均根数及根生长状况,并记录每个处理根诱导时间. 观察期为30 d.

生根率=(生根株数/诱导株数)×100%

每株苗平均根数=总根数/诱导株数

2 结果和分析

2.1 不同消毒时间对外植体污染率的影响

不同消毒的时间对外植体污染率的影响,经方差分析和多重比较,从消毒时间来看,综合污染率和成活率情况,虎掌南星较适合的消毒方式是经75%酒精浸泡30 s后,用0.1%氯化汞处理15 min左右,然后无菌水冲洗5~8遍. 污染率为0,死亡率低,出愈率为100%,与另外的处理相比有极显著差异. 具体分析结果见表2.

表2 0.1%氯化汞不同消毒时间对虎掌南星污染率的影响

注:小写字母表示0.05差异显著水平,下同.

2.2 不同器官愈伤组织的诱导情况

根据植物细胞具有全能性的特点,本试验采用虎掌南星的叶片、茎段、果实和块茎4个部位作为外植体,进行愈伤组织诱导情况的对比,其结果见表3.

表3 虎掌南星不同部位对愈伤组织诱导的影响

从表3可以看出,虎掌南星的块茎是最适合诱导愈伤组织的外植体,其他3个部分都没有愈伤组织产生. 块茎作为外植体的平均愈伤诱导率及愈伤组织发生时间与叶片、茎和果实作为外植体的平均愈伤诱导率及愈伤组织发生时间有极其显著的差异.

2.3 芽的诱导情况

芽的诱导情况见表4.

表4 芽诱导试验结果

2.4 生根培养情况

经观察虎掌南星愈伤组织在分化培养基上,大约10 d,便可以在诱导芽的培养基中有不定根的发生,说明该植物生根较容易. 但将这样的苗切割下来进行练苗移栽不易成活,所以有必要进一步对其进行根的诱导. 在不同的生根培养基中的生根结果如表5所示.

表5 基本培养基及NAA浓度对生根的影响

在以上8个处理中,试验号为10的处理外,其余7个处理的生根率都达到了100%,但是明显在试验号1~2上即基本培养基为MS的根比较细长,而试验号为3~6,即基本培养为1/2MS上生长的根比较粗且长. 从生根所需天数来看,随着NNA浓度的升高,诱导所需的时间也逐渐缩短,但是,NAA浓度为1.0时,生长出来的根不利于后期移栽的成活,所以,综合生根数、生根所需天数以及生根的长度考虑,最适合的配方是1/2MS+NAA0.1 mg/L,即试验号为15的配方.

3 讨论

综合前面的数据分析,本研究获得了如下主要结论:

虎掌南星的最佳外植体是块茎, 0.1%升汞最适宜消毒时间为15 min,消毒后的块茎接种于MS+BA4.0 mg/L+2,4-D0.5 mg/L培养基上,每天14h光照培养能达到100%的出愈率.

芽的诱导最适培养基是MS+BA 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L,诱导率可达100%,诱导时间为19 d,在诱导10 d后,每块愈伤组织上平均出现芽19个.

根的诱导以1/2MS+NAA 0.1 mg/L为最佳组合,诱导根发生需要的时间为19 d,平均生根数为6条.

幼苗生根后,置于室温自然光下练苗7d,然后连同整块愈伤组织转移到腐殖土:细沙(1∶1)的灭菌基质中,成活率可达到83.3%.

[1] 汪 蕾, 张继振. 天南星属植物研究进展[J]. 延边大学学报(自然科学版), 2004,30(1).

[2] 盛玉婷. 植物组织技术及应用进展[J]. 安徽农学通报, 2008,14(9).

[3] 杜树山, 孟 蕾, 徐艳春,等. 天南星属植物研究进展(综述)[J].北京中医药大学学报, 2001,24(3).

[4] 薛 淮, 刘 敏, 张纯花. 中国药用植物组织培养研究进展[J].植物杂志,2002(1).

[5] 陈文武, 彭兰华. 药用植物的组织培养的应用[J]. 陕西农业科学,2006(5).

[6] 郭余龙, 贾永芳, 杨星勇,等. 半夏的组织培养及其成分比较[J]. 农业生物技术学报, 2003,11(3).

[7] 罗光明, 杨雅琴, 何 雁.半夏的快速繁殖与胚状体诱导[J].江西中医学院学报, 2003,15(2).

[责任编辑 冰 竹]

The Preliminary Research on the Tiger Palm South Star Tissue Culture

LU Yun1,HAN Shuang2

(1.ShangqiuVocationalandTechnicalCollege,Shangqiu476100,China;2.KeyLaboratoryofPlant-MicrobeInteractions,DepartmentofLifeScience,ShangqiuNormalUniversity,Shangqiu476000,China)

Taking the tuber of tiger palm nanxing (Rhizoma Pinelliae PedatisECTae,) as test materials, with different disinfection treatment on tiger palm south star explant for sterilization, the preliminary study of the multiple shoot clumps is carried out. The experiment is that after washing clean sterilization 30s, using 75% ethanol solution and then disinfected with 0.1% HgCl2, the tiger palm south star explant is cleaned for 15 minutes, every time washing 5 times with sterile water after disinfection, every time 3 minutes. The results of this method of handling show that the pollution rate is low. From the power of the average callus induction rate of callus quality point of view, tiger palm south star callus induced on MS is better than that of B5.

Rhizoma Pinelliae PedatisECTae;the sterilization method;medium

2015-03-13

河南省科技厅基础与前沿项目(项目编号:142300410321);商丘市科技局项目(项目编号:20121043);河南省重点科技攻关项目(项目编号:142102310484)

逯 昀(1975- ),女,河南民权人,商丘职业技术学院副教授,硕士,主要从事园艺植物的组织培养研究。

1671-8127(2015)02-0083-04

S567.239

A

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