格氏李斯特菌脉冲磁场杀菌效果研究

吴 平,曾 义,王薇薇,郁晓晨,任珊珊,马海乐

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

格氏李斯特菌脉冲磁场杀菌效果研究

吴 平,曾 义,王薇薇,郁晓晨,任珊珊,马海乐*

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

以自行研制的脉冲磁场杀菌设备对格氏李斯特菌进行杀菌实验,研究了格氏李斯特菌的生长时期、脉冲磁场参数(强度、脉冲数),介质参数(温度、Na+浓度、pH)等对脉冲磁场杀菌效果的影响。结果表明:格氏李斯特菌在对数生长中期对脉冲磁场最为敏感;脉冲磁场对格氏李斯特菌的杀菌效果产生生物学窗口效应,不同的磁场强度杀菌时,2.5T和4.0T残留率出现谷值;不同的脉冲数杀菌时,25个脉冲数残留率达到谷值;当介质温度为30℃时,残留率最低,较低或较高温度的介质中,杀菌效果较差;Na+对脉冲磁场的杀菌效果有一定的协同作用;较低或者较高的pH促进了脉冲磁场的杀菌作用,pH为9.0时残留率最低;对2.5T,25个脉冲数处理的格氏李斯特菌进行扫描电镜观察时发现菌体细胞膜破裂,胞内物质外溢,这可能是脉冲磁场造成格氏李斯特菌死亡的原因。

脉冲磁场,格氏李斯特菌,杀菌,窗效应,扫描电镜

微生物是引起食品腐败变质的主要因素,目前在食品工业中主要采用热杀菌技术如巴氏杀菌、UHT杀菌等进行灭菌处理。热杀菌使食品中腐败菌细胞内的蛋白质凝固变性,导致细菌失活,但是食品受热后,常会发生物理或化学性质的变化,造成其色、香、味、组织结构的改变,破坏食品中的天然和营养成分[1-2]。由于热杀菌技术无法满足热敏性食品的杀菌要求,同时,消费者对于食品的品质要求越来越高,因此,非热加工技术得到了巨大的发展[3]。非热杀菌在低温环境下进行,在杀灭微生物的同时,能够最大限度地保留食品的营养成分和风味。脉冲磁场杀菌技术作为非热杀菌技术的一种,得到了各方面的关注。到目前为止已经有较多的研究[4-10]表明,高强度脉冲磁场杀菌技术对微生物有一定的杀菌效果。但也有学者认为高强度脉冲磁场不具备杀菌能力[11]。脉冲磁场杀菌的研究还处于初步阶段,其真正的杀菌机理还不明确并且存在争议,其有待学者的进一步研究。格氏李斯特菌是李斯特菌中的一种,它虽对人和动物的危害相对较小,但因可作为致病李斯特菌检测鉴定的指示菌而受到关注[12]。实验以格氏李斯特菌为对象,研究脉冲强度、脉冲数,介质温度、pH、Na+浓度等对脉冲磁场杀菌的影响,从而为高强度脉冲磁场杀菌技术在食品冷杀菌工业化中的应用提供必要的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

格氏李斯特菌(ListeriagrayiATCC 19120) 中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC);牛肉浸膏、鱼粉蛋白胨、琼脂粉、氯化钠、磷酸二氢钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钾、戊二醛、无水乙醇、乙酸异戊酯 购置于上海国药集团化学试剂有限公司;脉冲磁场杀菌设备 自行研制,专利号ZL0322055111;LZ-610H型特斯拉计 湖南娄底市联众科技有限公司;LRH-250型生化培养箱 上海一恒科学仪器有限公司;IS-RDD3型台式恒温振荡器 南京畅翔仪器设备有限责任公司;YM30Z型高压灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;WFJ7200型可见光分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司;PHS-3TC型酸度计 上海大普仪器有限公司;SW-CJ-2FD型净化工作台 苏州净化设备有限公司;XH-C型漩涡混匀器 常州金坛市医疗器械厂;600型恒温水浴锅 江苏金坛市中大仪器厂。

1.2 工作原理

脉冲磁场杀菌装置的主体主要包括两大部分,脉冲磁场发生器和杀菌室。脉冲磁场发生器产生的脉冲磁场通过螺线管作用于杀菌处理室中的物料。此外,杀菌过程也需要一些辅助装置,磁屏蔽外壳防止漏磁,温控装置控制杀菌室的温度,特斯拉计测量处理室内的磁场强度。脉冲磁场杀菌装置的电路原理是稳压直流电源由桥式整流电路提供,储能电容储存磁能,晶闸管开关负责电能和磁能的无缝转换。当开关接通A时,高压直流电源通过限流电阻R0向电容器充电,至电容器上两端的电压为V值。然后将开关接通B,则电容器通过线圈和电阻R放电,在线圈中产生磁场并生成感应电流,接着线圈上的电流又向电容器充电直至接近电压V值,电容器又沿反方向向电阻R和线圈放电,线圈中又产生反方向磁场[13]。如此反复充放电以产生脉冲磁场。

1.3 实验方法

1.3.1 脉冲磁场杀菌操作 开机预热10min,调节调压旋钮至所需电压,用特斯拉计确定所需磁场强度,然后将菌液送入杀菌室进行处理。脉冲数采用人工计数方法。完成一个杀菌作业后,取出菌液,装置停止工作3min进行冷却,再进行下一组的杀菌作业。

1.3.2 菌液的制备 取出斜面冷藏的格氏李斯特菌种进行活化,挑取一至三环接入已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中,37℃培养10～12h,而后按5%的接种量接入已灭菌的150mL的液体培养基中,37℃,140r/min培养8h后,取5mL菌液进行杀菌实验。

1.3.3 实验参数设置 菌液温度保持在37℃,pH7.4,采用磁场强度2.5T,脉冲数25个对格氏李斯特菌进行杀菌处理,以不经脉冲磁场处理的相同菌液为对照。保持其他条件不变,采取冰浴及恒温箱冷却和恒温水浴锅加热的方式控制菌液温度分别为5、10、15、20、25、30、35、40℃;采用0.5mol/L H3PO4以及0.5mol/L NaOH调节菌液pH分别为5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0;采用称量不同质量NaCl固体溶解于培养基中,控制菌液Na+浓度分别为45、55、65、75、85、95、105、115mmol/L。

1.3.4 菌落总数的测定 杀菌完成后,吸取1mL菌液,按1∶10的比例进行梯度稀释,选取适宜的三个稀释梯度的菌液,用倾注法进行平板接种,每个稀释度做三个平行;将接种后的平板在37℃下,培养48h。培养结束后,对平板上的菌落进行计数。以杀菌前的菌液作对照,计算残留率。格氏李斯特菌残留率计算公式:

(1)

式中,N为杀菌后菌液中李斯特菌数,CFU/mL;N0为杀菌前的菌数,CFU/mL。

1.3.5 生长曲线的测定 在48支试管(三组平行)中分别分装已灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基各4.75mL,准确吸取格氏李斯特菌培养液0.25mL接种到上述试管中,37℃,140r/min振荡培养。每隔1h取出三支试管标号放入冰箱4℃保存,培养时间结束后以未接种的培养基为空白组在600nm下测量OD值。浓度较高的菌液用培养基稀释适当倍数后测定,记录OD值时乘以稀释倍数。以菌悬液的OD值为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制生长曲线。

1.3.6 不同对数生长期的格氏李斯特菌残留率测定 对分别培养2～10h的格氏李斯特菌在2.5T,25个脉冲下进行杀菌处理,进行菌落计数,计算残留率。

1.3.7 扫描电镜观察 脉冲磁场处理前后的菌液5000r/min离心15min,弃上清液,PBS清洗3次,2.5%的戊二醛在4℃下固定过夜。弃固定液,PBS清洗3次,乙醇梯度脱水(30%、50%、70%、80%、90%、95%)各1次,100%乙醇清洗3次,乙酸异戊酯清洗2次,每次均浸泡15min,10000r/min离心5min。样品在-20℃冷冻过夜,-80℃冻干12h,备用。以上所有操作均在4℃下进行。

2 结果与讨论

2.1 李斯特菌生长时期对杀菌效果的影响

测得格氏李斯特菌的生长曲线如图1所示,0～1h为延滞生长期,1～11h为对数生长期,12h后进入稳定生长期。

图1 格氏李斯特菌生长曲线Fig.1 Listeria grayi growth curve

有研究表明微生物处于对数生长期时比延滞生长期和稳定生长期对脉冲磁场更为敏感[9],但关于敏感性在对数生长期的不同时间段是否存在差异的研究却较少。对培养2、4、6、8、10h处于对数生长期不同时间的格氏李斯特菌进行杀菌,发现格氏李斯特菌处于对数生长期不同时间段对磁场的敏感程度有所不同,处于对数生长中期时,杀菌效果最好,尤其是对培养8h时的格氏李斯特菌进行杀菌时,残留率最低,如图2所示。这可能是因为格氏李斯特菌在对数生长中期时繁殖分裂速度最快,正在建立人工感受态,对外界环境变化最为敏感。

图2 不同对数生长期对脉冲磁场杀菌效果的影响Fig.2 Effect of different logarithmic growth phase on the sterilizing effect of PMF

2.2 脉冲磁场强度对杀菌效果的影响

图3 脉冲磁场强度对杀菌效果的影响Fig.3 Effect of PMF intensity on the sterilizing effect

菌液初始温度30℃,菌液pH7.4,脉冲数分别为15、20和25个时,不同磁场强度下的杀菌效果见图3。由图3可知,格氏李斯特菌残留率随着脉冲磁场强度的增大呈现波动变化趋势,在2.5T,4T时出现谷值,而在2T,3.5T时出现峰值,这种波动现象在前人的研究中也被频繁发现,符合电磁波生物学窗效应的特征,该效应是指生物体只有受特定频率参数与特定强度参数恰当组合的电磁波作用时才能产生最佳作用效果的一种生物学现象。脉冲磁场造成格氏李斯特菌死亡的原因可能是由于菌体细胞膜在周期性脉冲场的反复冲击下各种离子更易渗透进入细胞中,造成细胞各细胞器发生膨胀[14],胞内压力超过细胞膜所能承受的压力后,造成了细胞膜的破裂。3.5T,20个脉冲数处理时,脉冲磁场促进了格氏李斯特菌的生长,这可能是由于3.5T,20个脉冲数处于杀菌效应的窗口外,其促进机理需要进一步的研究。脉冲磁场产生杀菌效应时需要在对应的杀菌窗口中进行,2.5T、4T均是脉冲磁场产生杀菌效应的强度窗口,但高场强下能耗较高,而且2.5T和4T处理时,残留率没有显著性差异(p>0.05),因此后面采用2.5T的脉冲强度进行杀菌实验。

2.3 脉冲数对杀菌效果的影响

菌液初始温度30℃,菌液pH7.4,磁场强度2、2.5、3T,不同脉冲数下的杀菌效果见图4。由图4可知,随着脉冲数的升高,格氏李斯特菌残留率呈波动变化。15、25个脉冲数时出现谷值,10、20个脉冲出现峰值。15、25个脉冲可能是脉冲磁场产生杀菌效应的时间窗口。而3T,10个脉冲、2T,20个脉冲处理时,脉冲磁场促进了微生物的生长。已有研究表明一定范围内的电磁能可以促进细胞的生长[15-16],但产生的机理尚不清楚。

图4 脉冲数对杀菌效果的影响Fig.4 Effect of the number of pulses on the sterilizing effect

2.4 介质温度对杀菌效果的影响

菌液pH7.4,采用磁场强度2.5T,脉冲数25个对格氏李斯特菌进行杀菌处理,不同介质温度下的杀菌效果见图5。由图5知,脉冲磁场处理后,格氏李斯特菌的残留率在5～30℃范围内随着温度的升高而下降,这说明温度的升高对脉冲杀菌有一定的协同作用。当达到30℃时,残留率达到最低63.48%,随后残留率又有所增加,这说明低温或者较高温度下(远低于热力致死温度),杀菌效果较差,这可能是由于对其不利的环境温度条件使得该菌发生抗逆性作用而导致对脉冲磁场有一定的抵触作用。而当环境温度在格氏李斯特菌最适生长温度(37℃)附近时,细菌处于代谢增殖的最佳时期,其对脉冲磁场的抵抗性增大,因此残留率在35℃时有所增加[17]。

图5 介质温度对杀菌效果的影响Fig.5 Effect of medium temperature on the sterilizing effect

2.5 Na+浓度对杀菌效果的影响

菌液温度30℃,pH7.4时,采用磁场强度2.5T,脉冲数25个对格氏李斯特菌进行杀菌处理,在介质中不同的Na+浓度对杀菌效果的影响见图6。从图6中可知,随着Na+浓度的增加,格氏李斯特菌残留率呈下降趋势,浓度在45～75mmol/L之间时下降较平缓,85mmol/L之后下降显著,并在115mmol/L时达到最低残留率29.41%。这可能是由于前者处于脉冲磁场作用下细胞所能承受的Na+浓度范围内,而达到85mmol/L后,超出脉冲磁场下细胞所能承受Na+浓度阈值,胞内外渗透压差显著增大,导致细胞大量破裂死亡。因此,Na+浓度对脉冲磁场杀菌具有协同作用,且浓度越高杀菌效果越好。

图6 Na+浓度对杀菌效果的影响Fig.6 Effect of concentration of Na+ on the sterilizing effect

2.6 pH对杀菌效果的影响

菌液温度30℃,采用磁场强度2.5T,脉冲数25个对格氏李斯特菌进行杀菌处理,不同的pH对杀菌效果的影响见图7。由图7可知,不同pH对脉冲磁场杀菌效果有较显著的影响。当pH为7.5时,残留率最大,pH7.5是格氏李斯特菌的最适生长pH,此时,细菌生长代谢最快,对脉冲磁场的抗性也较强,因此杀菌效果最差。当菌液是酸性或者碱性时,细菌残留率显著降低,说明介质pH不仅对细菌的生长代谢有一定的影响,而且可能使其对脉冲磁场的抗性也发生下降,从而使细菌死亡率增加。当pH大于7.0时,格氏李斯特菌残留率下降的幅度要比在pH小于7.0的环境中要大,这说明该菌在碱性环境中更易受脉冲磁场的影响而失活。

图7 介质pH对杀菌效果的影响Fig.7 Effect of medium pH on the sterilizing effect

2.7 扫描电镜观察

由图8可以看出,处理前的格氏李斯特菌呈短杆状,细胞饱满,表面光滑。经磁场强度为2.5T,25个脉冲数的脉冲磁场处理后,细胞出现皱缩,表面出现褶皱,细胞与细胞之间发生黏粘。高强度脉冲磁场的反复作用可能造成格氏李斯特菌的细胞膜发生不同大小的电穿孔,一部分出现小孔的细胞膜在处理后的一段时间内会逐渐恢复成原样;而另一部分出现大孔的细胞膜则发生不可逆破裂,造成胞内物质的溶出,从而导致细胞死亡[18-19]。

图8 扫描电镜观察格氏李斯特菌微观结构Fig.8 The observation of microstructure of L.Grayi by SEM注：A为脉冲磁场处理前,B为脉冲磁场处理后。

3 结论

3.1 格氏李斯特菌在生长12h后进入稳定生长期,其在对数生长中期(8h)对外加的脉冲磁场更敏感,杀菌效果也更好。

3.2 脉冲磁场的杀菌残留率出现生物学窗口效应,不同的磁场强度杀菌时,2.5T和4T时残留率出现谷值;不同的脉冲数杀菌时,25个脉冲数残留率达到谷值。

3.3 采用2.5T,25个脉冲数对格氏李斯特菌进行杀菌时,随着温度的增加,脉冲磁场杀菌残留率总体呈下降趋势,在30℃时残留率达到最低,杀菌效果最好;Na+对脉冲磁场杀菌有一定的协同作用,低浓度的Na+对脉冲磁场杀菌的协同作用较弱,高浓度的Na+对脉冲磁场杀菌的协同作用较强;而过低或过高的pH都会提高杀菌效果。

3.4 扫描电镜观察发现,脉冲磁场造成格氏李斯特菌细胞出现皱缩,表面产生褶皱,这可能是外加的脉冲磁场造成了部分菌体细胞膜的破裂,胞内物质外溢,从而导致细胞发生不可逆的死亡。

[1]Rawson A,Koidis A,Rai D K,et al. Influence of sous vide and water immersion processing on polyacetylene content and instrumental color of parsnip(Pastinaca sativa)disks[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(13):7740-7747.

[2]Patras A,Brunton N P,O’Donnell C,et al. Effect of thermal processing on anthocyanin stability in foods;mechanisms and kinetics of degradation[J]. Trends in Food Science & Technology,2010,21(1):3-11.

[3]Manas P,Barsotti L,Claude C P. Microbial Inactivation by pulsed electric fields in a batch treatment chamber:effects of some electrical parameters and food constituents[J].Innovative Food Science& Emerging Technologies,2001(2):239-249.

[4]Haile M,Pan Z,Gao M,et al. Efficacy in microbial sterilization of pulsed magnetic field treatment[J]. International Journal of Food Engineering,2008,4(4):1-14.

[5]Wosnitzaa J,Bianchia A D,Freudenbergerb J,et al. Dresden pulsed magnetic field facility[J]. Journal of Magnetism and Magnetic Materials,2007,310:2728-2730.

[6]曹辉,马海乐. 脉冲磁场对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀灭效果的实验研究[J].食品工业科技,2003,24(4):29-31.

[7]高梦祥,马海乐,郭康权. 西瓜汁的脉冲磁场杀菌实验[J].食品与发酵工业,2004,30(3):14-17.

[8]杨巧绒,高梦祥,马海乐. 强脉冲磁场的杀菌效果及对食品品质的影响[J]. 微波学报,2005,20(3):82-85.

[9]王合利,马海乐,祝子坪,等. 大肠杆菌的脉冲磁场杀菌效果及规律性的研究[J]. 食品工业科技,2008(7):79-81.

[10]钱静亚,陈超,王晨燕,等. 介质参数对脉冲磁场杀灭枯草芽孢杆菌的影响[J]. 食品与机械,2012(5):8-11.

[11]San Martín M F,Harte F M,Lelieveld H,et al. Inactivation effect of an 18-T pulsed magnetic field combined with other technologies onEscherichiacoli[J]. Innovative Food Science & Emerging Technologies,2001,2(4):273-277.

[12]郭书林,陈信忠,龚艳清,等. PCR-RFLP 方法检测和鉴别五种李斯特菌[J]. 食品安全质量检测学报,2013(2):504-508.

[13]石秀东. 液态食品非加热杀菌技术的研究进展[J]. 冷饮与速冻食品工业,2002,8(4):37-44.

[14]Yin S,Chen X,Hu C,et al. Nanosecond Pulsed Electric Field(nsPEF)Treatment for Hepatocellular Carcinoma:A Novel Locoregional Ablation Decreasing the Lung Metastasis[J]. Cancer letters,2014,346(2):285-291.

[15]WolfFI,Torsello A,Tedesco B,et al. 50-Hz extremely low frequency electromagnetic fields enhance cell proliferation and DNA damage:possible involvement of a redoxmechanism[J]. Biochim BiophysActa,2005,1743(1-2):120-129.

[16]FitzsimmonsRJ,Gordon SL,Kronberg J,et al. A pulsing electric field(PEF)increases human chondrocyte proliferation through a transduction pathway involving nitric oxide signaling[J].J Orthop Res,2008,26(6):854-859.

[17]Cebrián G,Raso J,Condón S,et al. Acquisition of pulsed electric fields resistance inStaphylococcusaureusafter exposure to heat and alkaline shocks[J]. Food Control,2012,25(1):407-414.

[18]Rivas A,Pina-Pérez M C,Rodriguez-Vargas S,et al. Sublethally damaged cells of Escherichia coli by Pulsed Electric Fields:The chance of transformation and proteomic assays[J]. Food Research International,2013,54(1):1120-1127.

[19]Zhao W,Yang R,Shen X,et al. Lethal and sublethal injury and kinetics of Escherichia coli,Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in milk by pulsed electric fields[J]. Food Control,2013,32(1):6-12.

Study on the sterilization effect of pulsed magnetic fields onListeriaGrayi

WU Ping,ZENG Yi,WANG Wei-wei,YU Xiao-chen,REN Shan-shan,MA Hai-le*

(School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Effect of different growth phase,pulsed magnetic field(PMF)parameters(intensity,pulsed number),medium parameters(temperature,concentration of Na+,pH)on sterilizing effect ofListeriaGrayiby pulsed magnetic field were studied. The results indicated thatListeriaGrayiwas sensitive to pulsed magnetic field at the middle of log phase. Pulsed magnetic field generated biological window effect on sterilization effect ofL.Grayi. When different intensity used to sterilization,the survival rate reached valley value at 2.5T and 4T. When different pulsed number used to sterilization,the survival rate reached valley value at the number of 25. Low and higher temperature,the sterilization effect was worse,only in 30℃ the survival rate reached the minimum value. Na+had the synergistic effect to sterilization effect. Low and higher pH value increased the sterilizing effect,survival rate reached the minimum value when pH was 9.0. By scanning electron microscope to observe the samples after handled at 2.5T intensity and 25 pulsed number,the result showed that cells membrane rupture and intracellular material spill,this may be the death reason ofL.Grayiby PMF.

pulsed magnetic field;ListeriaGrayi;sterilization;window effect;scanning electron microscope

2014-06-27

吴平(1990-),男,硕士研究生,主要从事食品非热杀菌方向的研究。

*通讯作者:马海乐(1963-),男,博士,教授,主要从事食品功能因子及其分离技术研究。

国家自然科学基金资助项目(31271966);江苏大学科研项目(12A011)。

TS205.9

A

1002-0306(2015)07-0127-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.018