菝葜提取物抑菌作用研究

帅丽乔娃,郑国栋,黎冬明,张清峰

(江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045)

菝葜提取物抑菌作用研究

帅丽乔娃,郑国栋*,黎冬明,张清峰

(江西农业大学江西省天然产物与功能食品重点实验室,江西南昌 330045)

用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取经50%乙醇超声处理后的菝葜提取液。用四种供试菌,采用滤纸片法、最小抑菌浓度、半数抑菌浓度比较各萃取物的抑菌活性。结果:各萃取物对实验菌均有抑制作用,萃取物抑菌活性大小为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相,与萃取物中的总多酚、总黄酮含量有关。其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好,当其浓度为80mg/mL时,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌抑菌圈分别为13.6±0.12、13.2±0.10、12.9±0.07、(12.5±0.01)mm。乙酸乙酯相对四种菌的最小抑菌浓度分别为5、5、5、10mg/mL,其半数抑菌浓度分别为12.5、13.6、18.2、18.7mg/mL。结论:菝葜提取物有抑菌作用,特别是乙酸乙酯萃取物的抑菌效果最好。

菝葜,提取物,抑菌作用

目前使用的防腐剂绝大多数都是人工合成的,虽然价格低廉,但是过量的添加对食品的口感及人们的身体健康有不良影响,美国、英国、日本等已立法禁止使用的防腐剂有硼砂、水杨酸、对苯二酚、五氯酚、福尔马林,我国颁布的食品卫生标准也严格控制山梨酸及其盐类、丙酸及其盐类、苯甲酸及其盐类、对羟基苯甲酸及其酯类等用量。因此,开发高效、安全、稳定且便宜的新型天然防腐剂具有重要的意义[1]。由于天然提取物的安全优势,从植物中提取活性物质是天然物质研究的热门课题。很多中药具有清热解毒、抗菌等作用,能抑制病原微生物的生长,属理想的天然抑菌防腐材料[2]。这为植物源天然食品防腐剂、抑菌剂的研究和开发提供了宝贵资源。

菝葜是被子植物门百合科菝葜属植物菝葜的干燥根茎,俗称金刚藤、铁菱角,味甘、涩、微苦、性平,分布于我国长江以南及东南亚等地区。菝葜含有较多的黄酮、多酚、鞣质、有机酸、多糖及生物碱等活性物质[3]。研究表明菝葜对胃肠炎、疮疖、抗癌、梅毒、腰腿痛、风湿性关节炎等疾病有明显效果[4]。刘世旺等[5]经实验发现菝葜乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为0.14、0.18、0.46、0.44g/12mL培养基。邓家刚等经实验发现菝葜的6%水煎液和3%醇浸液对炭疽杆菌有抑菌作用[6],前人大多都是研究菝葜的醇提物、水提物的抑菌作用,本文除了研究醇提物和水提物外,还研究了石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层和正丁醇层的抑菌作用,提取物种类更多、更全面。实验以菝葜6种极性提取物为研究对象,以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌为实验菌株,采用滤纸片扩散法考察其抑菌效果、半数抑菌浓度和最低抑菌浓度,为研究菝葜抗菌活性和机理奠定实验基础,也为进一步开发与利用菝葜提供了研究数据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菝葜 江西南昌市药材店(产地:南昌),粉碎后过40目筛,得到样品,备用;乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇 均为分析纯,天津市永大化学试剂开发中心;琼脂粉、牛肉膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术责任有限公司;大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌 江西农业大学食品学院微生物实验室冷藏保管。

LAC-5040S高压灭菌锅、YLE-200恒温培养箱、BYY-200药品冷藏箱 上海申安医疗器械厂;KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.2 总酚含量的测定 称取一定量没食子酸,配成0.1mg/mL的没食子酸标准溶液。吸取0.25、0.30、0.35、0.40、0.45mL标准溶液到10.0mL容量瓶中,分别加入1mL福林酚试剂后,摇匀放置5min,再分别加入2.00mL 7%碳酸钠溶液,混匀,定容,室温避光放置1h后,在765nm波长处测定吸光度。

准确吸取待测样液0.5mL于10mL容量瓶,加入福林酚试剂1.0mL,充分混匀后,加入2.00mL 7%碳酸钠溶液,用蒸馏水定容,避光放置1h,于765nm测定吸光度值。根据回归方程计算样品中多酚类化合物的含量=(C1×10)/(M×V1×1000)式中:C1为样品浓度值(mg);M为样品质量(g);V1为量取样品体积,mL。

1.2.3 总黄酮含量的测定 称取一定量芦丁,用30%乙醇溶液配成0.124mg/mL的芦丁标准溶液。分别精密吸取标准溶液1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL放入10mL的容量瓶中,加5% NaNO2溶液1.0mL,摇匀放置8min,再加10% Al(NO3)3溶液1.0mL,摇匀,再放置6min,加4% NaOH溶液4.0mL,摇匀,定容,放置10min,以30%乙醇溶液作参比,在510nm波长处分别测定吸光度A。

样品的测定方法:取待测液0.5mL,用30%乙醇溶液稀释定容至25mL,准确移取V2mL,按上述方法显色,在510nm测定其吸光度,根据回归方程计算总黄酮量。样品黄酮含量=C2×25/(M2×V2×1000)。C2为样品溶液中黄酮含量,mg;V2为量取样品体积,mL;M2为样品的质量(g)。

1.2.4 细菌培养基的制备 牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠5g,水1000mL,pH7.2(配制固体培养基需加入20g琼脂),在0.1MPa下高压灭菌20min,备用。

1.2.5 供试菌株活化及菌悬液制备 将供试菌种接入试管斜面培养基上,于37℃,120r/min摇床中培养24h,培养完成后,置于4℃冰箱中冷藏备用。将配制好的液体培养基于121℃灭菌20min,室温冷却,用接种环从斜面培养基上挑取一环置于50mL灭菌液体培养基中,于37℃摇床中培养24h作为种子液,然后用无菌生理盐水洗脱配制成含菌数约为108个/mL的菌悬液备用[8]。

“言不尽意”是指语言存在着一定的局限性，不能完整地表达“圣人之意”。此不能用名言来完全表达的“圣人之意”实即圣人所领悟的“道”。《易传》认为“立象以尽意”，即“象”可以更直观地表达语言所不能及的“圣人之意”。孔颖达在《周易正义》说“凡易者象也，以物象而明人事者，若诗之比喻也”[10](P27)，而“立象以尽意”正可体现这种比喻，高亨在《周易杂论》一书中谈《周易》的艺术特点时也提及了其取象的这种特点：

1.2.6 菝葜不同极性提取物抑菌活性测定 将所得萃取物各取800mg,分别用10mL无菌水溶解得80mg/mL的药液,再以无菌水为溶剂对上述80mg/mL每种溶液分别进行两次稀释,每种萃取物得到80、40、20mg/mL三个浓度梯度的供试药液,用无菌水作对照,考虑到供试药液有限,本实验采用滤纸片法。选用优质滤纸直径为6mm圆形纸片,121℃高压灭菌30min,再经80℃烘干,置于干燥器中备用。取菌悬液0.2mL转移至之前倒好的平板培养基表面,均匀涂布,制成含菌平板。在制备好的纸片上滴加0.02mL不同浓度的供试液,待其干燥后贴入含菌平板中,每个平皿放三片,重复三次实验。在37℃的条件下培养24h后,用游标卡尺采用十字交叉法量取抑菌圈直径(mm)。通过测定抑菌圈直径大小评价不同组分对不同受试菌抑制作用[9]。

1.2.7 最小抑菌浓度 将不同菝葜提取物配制成80、40、20、10、5、2.5mg/mL的提取液。吸取0.1mL各菌悬液于培养基中,涂布均匀后,再用无菌镊子夹取分别浸有不同浓度菝葜提取液和无菌水对照液的滤纸片(6mm)分别贴于涂布后的含菌平皿上。完成后,置于37℃下培养24h。观察抑菌现象,以不长菌(抑菌圈>6mm)的最低浓度为最小抑菌浓度。

1.2.8 半数抑菌浓度 不同浓度的菝葜提取液加入到已灭菌的培养基中,混匀,加入到培养皿内,吸取200μL细菌菌悬液于其表面,用无菌涂布器将菌液涂布均匀。细菌在37℃下培养24h,并进行平板菌落计数,计算抑菌率。以无菌水作为对照。

表1 不同极性提取物总酚和总黄酮含量±s,n=3)

注:不同小写字母代表同行差异显著(p<0.05),不同大写字母代表同行差异极显著(p<0.01)。

表2 不同极性提取物对细菌的抑制作用(以抑菌圈直径表示,±s,n=3)

注:“-”表示未观察到明显的抑菌圈,抑菌圈直径以平均值和标准误差表示,抑菌圈直径包含原孔洞初始直径6mm。

每个浓度作3个平行样,运用Excel 2003处理数据,以样品浓度和抑制率作图,求出线性回归方程,抑制率为50%时的浓度即为半数抑菌浓度[10]。抑菌率(%)=(对照实验菌落数-相应浓度的菌落数)/对照实验的菌落数×100。

1.2.9 数据分析 采用DPS7.5版分析软件中的Duncan新复极差法对总酚、总黄酮含量、抑菌作用、最小抑菌浓度中的数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 总酚和总黄酮的回归方程

以没食子酸浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得回归方程为y=10.243x+0.0021,r=0.9991。以芦丁浓度作横坐标,吸光度作纵坐标,得回归方程为y=1.9373x+0.0103,r=0.9992。

2.2 菝葜不同萃取相总酚和总黄酮含量的比较

由表1可看出,菝葜不同提取物的总酚、总黄酮含量差异较大,乙酸乙酯相和正丁醇相中总酚、总黄酮含量高于其他萃取相,各萃取相中总多酚、总黄酮含量依次为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相。

2.3 菝葜不同极性提取物抑菌活性

由表2可知,6种极性提取物对四种供试菌均有一定的抑制效果,随着各极性提取物浓度上升,抑菌效果也加强,呈现剂量-效应关系。6种极性提取物对革兰氏阳性菌,如金黄色芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌,如大肠杆菌和沙门氏菌,说明菝葜提取物对革兰氏阳性菌的抑制效果更好。其中,乙酸乙酯相的抑菌效果最好,对实验用菌都有很好的抑菌效果,浓度为80mg/mL对金色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈达13.6、13.2mm。不同萃取物的抑菌效果强弱依次为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相。Smullen等[11]通过对多种植物多酚提取物的研究,发现多酚类化合物有明显抑菌作用。Pachaikani等[12]发现黄酮有抗菌,抗真菌功能。表1中不同萃取相的总酚、总黄酮含量与抑菌作用有明显相关性,说明其抑菌成分可能主要是黄酮与多酚类。

2.4 最小抑菌浓度

石油醚相,氯仿相的抑菌效果不明显,以下不进行最小抑菌浓度和半数抑菌浓度的研究。由表3可以看出,各萃取相对不同菌种的最小抑菌浓度都在4.83～20.11mg/mL。相对而言,乙酸乙酯萃取物最小抑菌浓度较低。

表3 不同极性提取物的最小抑菌浓度±s,n=3)

注:以不长菌(抑菌圈>6mm)的最低浓度为最小抑菌浓度。

2.5 半数抑菌浓度

从图1～图4可以看出,随细菌种类的不同和极性提取物不同,对同种和不同种类的细菌的半数抑菌浓度也不相同。乙酸乙酯相、正丁醇相、水相和醇提物对金黄色芽孢杆菌的半数抑菌浓度分别12.5、16.4、56.1、61.4mg/mL;对枯草芽孢杆菌的半数抑菌浓度分别13.6、18.3、62.6、65.8mg/mL;对大肠杆菌的半数抑菌浓度分别18.2、22.3、76.3、92.4mg/mL;对沙门氏菌的半数抑菌浓度分别18.7、21.0、71.8、73.1mg/mL。

图1 不同极性提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌率(n=3)Fig.1 The antibacterial rate of different polar extracts on Staphylococcus aureus(n=3)

图2 不同极性提取物对枯草芽孢杆菌的抑菌率(n=3)Fig.2 The antibacterial rate of different polar extracts on Bacillus subtilis(n=3)

图3 不同极性提取物对大肠杆菌的抑菌率(n=3)Fig.3 The antibacterial rate of different polar extracts on Escherichia.coli(n=3)

图4 不同极性提取物对沙门氏菌的抑菌率(n=3)Fig.4 The antibacterial rate of different polar extracts on Salmonella. Sp(n=3)

3 结论

3.1 菝葜不同极性提取物的抑菌活性实验表明,各极性提取物对4种致病菌均有一定的抑制作用,且呈剂量-效应关系。对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于革兰氏阴性菌。抑菌活性大小为:乙酸乙酯相>正丁醇相>水相>醇提物>石油醚相>氯仿相,抑菌作用与总酚和总黄酮的含量呈正相关性。其中乙酸乙酯相的抑菌效果最好,当其浓度为80mg/mL时,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌圈分别为13.6±0.12、13.2±0.10、12.9±0.07、(12.5±0.01)mm。

3.2 半数抑菌浓度实验和最小抑菌浓度实验表明,对同一供试菌,乙酸乙酯相比其它相的半数抑菌浓度和最小抑菌浓度都低,对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度为5、5、5、10mg/mL,半数抑菌浓度为12.5、13.6、18.2、18.7mg/mL。

3.3 本实验结果表明菝葜提取物有较好抑菌效果,其中乙酸乙酯萃取物抑菌效果最好。但其抑菌成分还不清楚,今后需要进一步研究。

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Study on antibacterial effect of extraction fromSmilaxChinaL.

SHUAI Li-qiaowa,ZHENG Guo-dong*,LI Dong-ming,ZHANG Qing-feng

(Key Laboratory of Natural Product and Functional Food,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

The 50% ethanol extraction fromSmilaxChinaL.(SCL)by ultrasonic were further exacted with petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol,respectively. Antibacterial activities of extraction were tested by the filter paper method,the minimum inhibitory concentration and half bacteriostatic concentration of four G+and G-strains. The results showed that the extractions of SCL had antibacterial effect on the test bacteria. The antibacterial activities of SCL’s different polar extracts were in sequence of ethyl acetate,n-butanol phase,aqueous phase,ethanol extract,petroleum ether,chloroform phase. The results were associated with content of polyphenols and flavonoids in extraction. The activity of ethyl acetate extraction was the strongest,and suppressed zones of theBacillussubtilis,Escherichiacoli,SalmonellaandStaphylococcusaureuswere 13.6±0.12,13.2±0.10,12.9±0.07,(12.5± 0.01)mm in 80mg/mL,respectively. The minimum bacteriostatic concentrations of ethyl acetate relative to the four strains were 5、5、5、10mg/mL,respectively,half bacteriostatic concentrations were 12.5,13.6,18.2,18.7mg/mL,respectively. The results showed that the extraction of SCL had antibacterial effects,and the effects of ethyl acetate extraction were the best.

SmilaxChinaL.;extraction;bacteriostatic effect

2014-06-25

帅丽乔娃(1989-),女,硕士研究生,研究方向:天然产物的分离提取。

*通讯作者:郑国栋(1969-),男,博士,副教授,研究方向:天然产物的分离提取、功能食品等。

国家科技部863计划(2013BAD10B04);国家自然科学基金(31160320)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.001