RhoGDI2与EMT相关蛋白在结直肠癌组织中表达的临床意义及相关性

陈 颖，姜昊声，马俐君，柳思琪，金珍婧，徐 庆

（1.上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科，上海200127；2.上海交通大学医学院附属同仁医院肿瘤科，上海200336；3.吉林大学第二医院肝胆胰内科，吉林长春130041）

RhoGDI2与EMT相关蛋白在结直肠癌组织中表达的临床意义及相关性

陈 颖1，2，姜昊声2，马俐君2，柳思琪3，金珍婧3，徐 庆1＊

（1.上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科，上海200127；2.上海交通大学医学院附属同仁医院肿瘤科，上海200336；3.吉林大学第二医院肝胆胰内科，吉林长春130041）

目的 探讨RhoGDI2与EMT相关蛋白（E－cadherin、Vimentin）在结直肠癌组织中表达的临床意义以及它们之间的相关性。方法 收集行手术切除且随访满5年的结直肠癌患者组织标本80例。应用免疫组化法检测标本中RhoGDI2与EMT相关蛋白的表达情况，分析它们与各临床病理参数间的关系，探讨RhoGDI2与EMT相关蛋白间的相关性。结果 RhoGDI2、E－cadherin、Vimentin在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为27.5%、23.6%、48.7%。结直肠癌组织中，RhoGDI2的表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05）；E－cadherin的表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05）；Vimentin的表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05）。结直肠癌组织中，RhoGDI2与Vimentin的表达呈正相关（r＝0.295，P＜0.05）；RhoGDI2、Vimentin与E－cadherin的表达呈负相关（r＝－0.278、r＝－0.309，P＜0.05）。结论 RhoGDI2与EMT相关蛋白在结直肠癌组织中的表达密切相关，我们推测RhoGDI2可能通过促进EMT的发生导致了结直肠癌的侵袭、转移及不良预后。

结直肠癌；RhoGDI2；EMT

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1465）

结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，每年全球新发病例约120万，死亡病例约60万［1］。近年来，随着社会环境及生活模式的改变，结直肠癌在我国的发病率、死亡率呈逐年上升趋势，已严重危害到人民的身体健康［2］。肿瘤的侵袭、转移是结直肠癌患者预后不良的最主要原因，但其确切的生物学机制目前仍未明确。上皮－间质转化（epithelial－mesenchymal transi－tion，EMT）是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程，与包括结直肠癌在内的恶性肿瘤侵袭、转移的发生、发展紧密联系，E－cadherin表达的下降和Vimentin表达的增加是EMT发生的重要标志［3，4］。RhoGDI2属鸟苷酸解离抑制因子（Rho GDP dissociation inhibitors，RhoGDIs）家族成员之一，具有调节在EMT发生中起着重要作用的RhoGTP酶活性的功能［5，6］。目前有研究发现，RhoGDI2的表达与结直肠癌的侵袭、转移密切相关［7］。本研究应用免疫组织化学法对RhoGDI2与EMT相关蛋白（E－cadherin、Vimentin）在结直肠癌组织中的表达进行检测，分析它们与结直肠癌各临床病理参数间的关系，探讨它们之间的相关性，为进一步阐明结直肠癌侵袭、转移相关生物学机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 标本与试剂

收集80例自2007年1月至2009年1月于上海交通大学医学院附属同仁医院行结直肠癌手术患者的原发癌组织、同期癌旁非癌组织石蜡标本及完整的临床资料。病理结果均由两位病理科医师共同诊断明确。全部病例术前均未行化疗、放疗及靶向治疗。80例患者中男性49例、女性31例；结肠癌57例、直肠癌23例；年龄28－84岁，中位年龄62岁。结直肠癌TNM分期按AJCC2010第七版标准，其中Ⅰ期22例，Ⅱ期17例，Ⅲ期21例，Ⅳ期20例。所有患者自术后起均通过门诊或电话随访至死亡或存活满5年。所涉及的标本及临床资料的获取均经医院伦理委员会批准，并得到患者及家属的知情同意。兔抗人RhoGDI2单克隆抗体购自Abcam公司；鼠抗人E－cadherin、Vimentin单克隆抗体，即用型羊抗兔鼠二抗和DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。

1.2 免疫组化法检测结直肠癌相关组织中RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin蛋白表达

按试剂盒说明书操作。以已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照；镜下观察组织细胞形态并拍照。

1.3 免疫组化检测结果判定

每张切片随意选取5个光镜视野（×200），每个视野观察200个细胞，由2位病理科医师盲法判读。计数阳性细胞判断标准：细胞浆或细胞膜见棕黄色染色颗粒。分级根据阳性细胞范围及染色强度，按范围：阳性细胞数低于26%为1分，26%至50%为2分，51%至75%为3分，高于75%为4分；按染色强度：与背景相似为0分，略高于背景为1分，明显高于背景为2分，深棕黄色强染色为3分。两组相加后予以分级：0－1分为（－）、2－3分为（＋）、4－5分为（＋＋），6分及以上为（＋＋＋）。分级为（－）、（＋）的定义为阴性，（＋＋）、（＋＋＋）的则定义为阳性。

1.4 统计学处理

应用SAS9.0软件进行统计学分析，计数资料组间差异采用χ2检验进行比较。相关性分析采用Spearman相关分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在结直肠癌组织及癌旁非癌组织中的表达

免疫组化结果（图1）提示，阳性细胞呈棕黄色染色，RhoGDI2、Vimentin主要表达于细胞浆，E－cadherin主要表达于细胞浆／膜。在80对配对的组织中，RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在结直肠癌组织和癌旁非癌组织中的阳性表达率分别为27.5%（22／80）vs5%（4／80）、23.6%（19／80）vs91.2%（73／80）、48.7%（39／80）vs6.3%（5／80），差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 三种标志物在结直肠癌组织及癌旁非癌组织中的表达（DAB，×200）

2.2 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在结直肠癌组织中的表达与临床病理参数的关系

80例结直肠癌组织免疫组化检测的结果提示，RhoGDI2表达与肿瘤的浸润深度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、肿瘤位置、大小及分化程度无关（P＞0.05）；E－cadherin表达与肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、肿瘤位置及远处转移无相关（P＞0.05）；Vimentin表达与肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移、远处转移、TNM分期及5年生存率相关（P＜0.05），与患者的性别、年龄、肿瘤位置及浸润深度无相关（P＞0.05）（表1）。

2.3 RhoGDI2、E－cadherin和Vimentin在结直肠癌组织中表达的相关性

22例RhoGDI2阳性表达的结直肠癌患者中，Vimentin阳性表达16例，E－cadherin阳性表达1例；19例E－cadherin阳性表达的结直肠癌患者中，Vimentin阳性表达4例。行Spearman相关性分析显示，RhoGDI2与Vimentin在结直肠癌组织中的表达呈正相关（r＝0.295，P＜0.05）；RhoGDI2、Vimentin与E－cadherin在结直肠癌组织中的表达呈负相关（r＝－0.278、r＝－0.309，P＜0.05）（表2）。

3 讨论

RhoGTP酶是具有GTP酶活性的小分子G蛋白，作为细胞的分子开关控制着众多信号传导通路，其生物学活性通过与GDP或GTP结合间的循环来调节，从而起着调控细胞骨架形态、细胞分裂增殖及细胞变形的作用［8］。不同于鸟苷酸交换因子（guaninenucleotide exchanging factors，GEFs）单向激活、GTP酶活化蛋白（GTPase activating proteins，GAPs）单向抑制的功能，鸟苷酸解离抑制因子（guaninenucleotide dissociation inhibitors，RhoGDIs）具有双向调节RhoGTP酶的作用。RhoGDIs在细胞质中与RhoGTP酶结合后使之处于失活状态，无法有效结合效应靶蛋白［9］；另一方面，RhoGDIs在细胞膜与活性形式的Rho、Rac1、cdc42相结合，进而抑制GTP酶活化蛋白，避免了RhoGTP酶被水解，使之处于有效的活性状态［10，11］。相较于庞大的GEFs和GAPs调节因子家族，目前只有3种人RhoGDIs被发现：RhoGDI1、RhoGDI2和RhoGDI3［12－14］。作为RhoGDIs家族中表达最丰富的成员，RhoGDI2最初被发现特异性地表达于造血组织中，由201个氨基酸构成，分子量为27kDa。近年来越来越多的研究发现，RhoGDI2也特异性表达于多种非造血组织肿瘤之中。RhoGDI2在膀胱癌细胞株中的表达与肿瘤细胞的侵袭能力呈反比，RhoGDI2表达的减少与晚期膀胱癌患者的预后不良密切相关，揭示了其可能是一个肿瘤抑制因子［15，16］。另一方面，RhoGDI2在卵巢癌中的表达却显著高于卵巢良性腺瘤［17］。此外，RhoGDI2在乳腺癌细胞中呈高表达，具有促进肿瘤细胞体外侵袭、转移能力的作用［18］。这反映了RhoGDI2也可能是一个肿瘤促进因子。以上的差异也许是RhoGDI2在不同的肿瘤类型或遗传背景中对RhoGTP酶采取了不同的调控方式所造成的。本研究结果显示，RhoGDI2在结肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁非癌组织，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结直肠癌患者中，RhoGDI2阳性表达者与阴性表达者相比，具有更深的肿瘤浸润深度、更高的肿瘤转移率，更晚的TNM分期以及更低的5年生存率。与Li等［7］的研究相一致，表明了RhoGDI2在结直肠癌中具有促进肿瘤侵袭、转移及不良预后的作用。

肿瘤发生侵袭、转移时首先需要打破与周围细胞间的紧密连接，突破基底膜屏障，侵入周围间质，然后再进入血液循环，最终定植于远处器官。近年来，这一系列的变化被认为与上皮－间质转化（EMT）密切相关［19］。上皮细胞表型蛋白E－cadherin表达的减少，间质细胞表型蛋白Vimentin表达的增加是EMT发生的重要标志。本研究通过免疫组化法发现，E－cadherin在结肠癌组织中的阳性表达率明显低于癌旁非癌组织。E－cadherin阳性表达的结直肠癌患者具有肿瘤原发病灶较小、分化程度较好、浸润深度较浅、无淋巴结转移以及TNM分期较早的临床病理特点，5年生存率显著优于阴性表达的患者。Vimentin则与之相反，在结直肠癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁非癌组织，且与结直肠癌患者肿瘤原发灶大、分化程度差、淋巴结转移、远处转移、TNM分期晚及5年生存率低密切相关。这反映出结直肠癌侵袭、转移的机制中确实存在EMT的过程，EMT是导致患者不良预后的重要因素之一。RhoGTP酶可通过ROCK信号转导通路促进EMT的发生、发展［6］，因此本研究对RhoGTP酶上游蛋白RhoGDI2与下游EMT相关蛋白（E－cadherin、Vimentin）在结直肠癌组织中的表达进行了Spearman相关性分析。结果显示，RhoGDI2与E－cadherin表达呈负相关，与Vimentin的表达呈正相关，反映了结直肠癌组织中RhoGDI2与EMT相关蛋白间的表达存在一定的相关性。据此我们推测RhoGDI2可能通过对RhoGTP酶的调控促进了肿瘤EMT的发生、发展，诱发了结直肠癌的侵袭、转移，从而导致了患者不良的预后。

我们的研究表明了RhoGDI2与EMT相关蛋白（E－cadherin、Vimentin）在结直肠癌组织中的表达密切相关，RhoGDI2具有促进结直肠癌侵袭、转移，导致预后不良的作用，且至少有部分可能是通过参与了肿瘤EMT的过程来实现的。这为我们进一步深入研究RhoGDI2在结直肠癌中的作用机制奠定了基础。

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Clinical significance and correlation of RhoGDI2 and EMT－related proteins expression in colorectal carcinoma tissues

CHEN Ying，JIANG Hao－sheng，MA Li－jun，et al.（Department of Gastrointestinal Surgery，Renji Hospital，School of medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200127，China）

Objective To investigate the clinical significance and correlation of RhoGDI2and EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）expression in colorectal carcinoma tissues.Methods The tissue specimens from 80patients that were surgical resected for CRC and follow－up for over 5years.The expression of RhoGDI2and EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）were assessed by immunohistochemistry.The associations of their expression with clinicopathological parameters and themselves were analyzed.Results The positive expression rate of RhoGDI2，E－cadherin and Vimentin was 27.5%，23.6%，48.7%respectively in CRC tissues.In CRC tissues，the expression of RhoGDI2were associated with the depth of invasion，lymph node metastasis，distant metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）；the expression of E－cadherin were associated with the tumor size，differentiation，depth of invasion，lymph node metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）；the expression of Vimentin were associated with the tumor size，differentiation，lymph node metastasis，distant metastasis，TNM stage and 5－year survival（P＜0.05）.The expression of RhoGDI2with Vimentin showed positive correlation（r＝0.295，P＜0.05）；the expression of RhoGDI2，Vimentin with E－cadherin showed negative correlation（r＝－0.278，r＝－0.309，P＜0.05）.Conclusion The expression of RhoGDI2was significantly associated with EMT－related proteins（E－cadherin，Vimentin）in CRC tissues.We speculate that RhoGDI2 may cause CRC invasion，metastasis and poor prognosis by promoting EMT occurrence.

Colorectal Cancer（CRC）；RhoGDI2；EMT

R735.3＋5 R735.3＋7

A

2015－02－25）

1007－4287（2015）09－1465－05

上海市卫计委面上项目（20114194）；吉林省发改委项目（3J113Z583429）；上海市长宁区卫计委面上项目（20114Y02003）

＊通讯作者