重楼皂苷通过内质网应激抑制荷瘤小鼠移植瘤生长

张嘉玲，郑长军，杨瑞琦，王 飞，范丽梅

（吉林大学第二医院，吉林长春130041）

重楼皂苷通过内质网应激抑制荷瘤小鼠移植瘤生长

张嘉玲，郑长军，杨瑞琦，王 飞，范丽梅＊

（吉林大学第二医院，吉林长春130041）

目的 探讨重楼皂苷Ⅶ联合顺铂抑制荷瘤小鼠移植瘤生长的分子机制。方法 SKOV3细胞皮下接种NOD／SCID小鼠，待移植瘤形成后，荷瘤小鼠随机分为4组（n＝10）：对照组、低剂量重楼皂苷Ⅶ组（LD组）、中剂量重楼皂苷Ⅶ组（MD组）、高剂量重楼皂苷Ⅶ组（HD组）。15天后，分离肿瘤组织，测定肿瘤体积和重量及抑瘤率；TUNEL染色和Western blot检测肿瘤细胞凋亡及其机制。结果 在HD组中，肿瘤重量抑制率达57.98%，体积抑制率达55.11%，细胞凋亡率达42.39%，与对照组相比有统计学差异。经重楼皂苷作用后，凋亡相关基因Bcl－2表达减少，Bax蛋白表达增加；内质网相关基因GRP78和CHOP表达均增加。结论 重楼皂苷能有效促进肿瘤细胞凋亡，并且这种凋亡是由内质网应激介导的。

重楼皂苷Ⅶ；移植瘤；凋亡；内质网应激

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1450）

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，其发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，严重威胁女性的健康。目前临床上卵巢癌的治疗方案主要采用手术治疗联合化疗等综合治疗，但其疗效也受到一定限制。研究表明，重楼皂苷作为一种有效的中草药具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡等作用，其主要有效成份是重楼皂苷Ⅶ［1－3］。我们前期研究表明重楼皂苷Ⅶ可有效抑制人肺腺癌细胞A549增殖和卵巢癌细胞SKOV3增殖，并诱导其凋亡，表明重楼皂苷Ⅶ具有良好的抗肿瘤作用。本研究联合重楼皂苷Ⅶ和顺铂对接种SKOV3细胞的荷瘤小鼠进行灌胃给药，观察重楼皂苷Ⅶ在体内抑制肿瘤的效果，并明确其机制。

1 材料和方法

1.1 细胞培养

SKOV3细胞购自美国ATCC细胞库，在含10%胎牛血清中的IMDM培养液中，5%CO2，37℃细胞培养箱中培养。细胞在倒置显微镜下形态为细胞较大，贴壁生长，核大，细胞生长速度较慢。每隔3天传代一次，待传代细胞数量达到实验所需量时，取对数生长期细胞配成细胞悬液，计数活细胞浓度达到1×107个／ml，准备接种裸鼠。

1.2 荷瘤小鼠模型建立

50只雄性NOD／SCID小鼠购自吉林大学实验动物中心，在无菌通风环境中单笼饲养。接种部位为裸鼠右侧腋部皮下，接种量为200μl卵巢癌耐药细胞SKOV3。接种后每天观察移植瘤生长状况，当移植瘤长径长至1cm左右时，准备后续实验。

1.3 动物给药

在所有荷瘤小鼠中，挑选40只移植瘤形成小鼠，随机分为4组（n＝10）：对照组、低剂量重楼皂苷Ⅶ（50mg／kg）＋顺铂组（LD组）、中剂量重楼皂苷Ⅶ（250mg／kg）＋顺铂组（MD组）、高剂量重楼皂苷Ⅶ（500mg／kg）＋顺铂组（HD组）。在所有组中，顺铂用量为50mg／kg，对照组用生理盐水代替。小鼠灌胃给药，每天1次，共15天。15天后，处死小鼠，分离肿瘤组织，测定肿瘤体积和重量及抑瘤率。肿瘤体积等于V＝1／2（长径×短径2），重量抑瘤率（%）＝（1－实验组平均瘤重／对照组平均瘤重）× 100%，体积抑瘤率（%）＝（1－实验组平均体积／对照组平均体积）×100%。

1.4 TUNEL染色

肿瘤组织用10%福尔马林固定24h后，制成石蜡切片，切片常规脱蜡入水后，用罗氏公司TUNEL试剂盒进行凋亡染色，具体操作按说明书进行。之后，染色切片在400倍的光学显微镜下，随机选取5个视野计算凋亡百分数的平均数（average rate of apoptosis，ARA）。

1.5 Western blot

将100mg肿瘤组织置于液氮中研磨至粉末，加入裂解液，BCA法蛋白定量，调整蛋白浓度至浓度为2.5μg／μL，震荡混匀后，100℃煮5min，12 000g离心5min，上样50μg，电泳条件：浓缩胶恒压80V，约20min；分离胶恒压100V。半干电转膜仪转膜（30mA，90min）；5%脱脂奶粉封闭，之后加入羊抗鼠Bax、Bcl－2、兔抗鼠GRP78、CHOP一抗4℃过夜，TBST洗膜，添加HRP标记的二抗，室温轻摇30 min；然后加入ECL发光液，X线胶片曝光。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 重楼皂苷抑瘤率

所有小鼠在实验周期结束前均存活，存活率为100%。肿瘤剥离后称取重量，测量肿瘤长径和短径，然后计算肿瘤体积。测量结果显示低剂量重楼皂苷Ⅶ（LD组）能轻微抑制肿瘤生长，而中剂量和高剂量（MD和HD组）能有效抑制肿瘤生长，其重量抑制率达52%和57.98%，体积抑制率分别达45.12%和55.11%，重量和体积与对照组相比具有显著统计学差异（P＜0.05，表1）。

表1 重楼皂苷Ⅶ处理荷瘤小鼠后肿瘤重量和体积变化

2.2 重楼皂苷促进肿瘤细胞凋亡

TUNEL染色检测肿瘤细胞凋亡发现，在MD和HD组中，多数细胞核呈棕色颗粒，可见细胞表面伪足出现，微绒毛等消失，细胞皱缩，变形，体积变小，细胞核中染色质浓缩，早期染色质聚集于核膜边呈新月形或环形，晚期碎裂。LD组中凋亡细胞相对较少，与对照组相比没有明显差异。四组中细胞平均凋亡率（ARA）见图1，其中，MD和HD组与对照组相比有显著的统计学差异（P＜0.05）。

图1 重楼皂苷Ⅶ处理荷瘤小鼠后肿瘤细胞凋亡率

2.3 凋亡相关蛋白Bax和Bcl－2表达变化

Bax和Bcl－2基因是两个重要的凋亡基因，Bax促进细胞凋亡，Bcl－2抑制细胞凋亡。Western blot结果显示随着重楼皂苷Ⅶ浓度的增加，Bcl－2表达减少，而Bax蛋白表达增加（图2），提示经重楼皂苷Ⅶ和顺铂联合作用后，肿瘤生长受到抑制，这也与TUNEL染色结果一致。

2.4 内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达

Western blot检测了内质网应激途径相关蛋白表达结果发现，重楼皂苷处理移植瘤后，GRP78表达明显上调，且存在剂量依赖效应，引起内质网应激，从而促进肿瘤细胞凋亡。同时，GRP78的上升也会引起上调CHOP的表达（图3），从而介导凋亡，提示重楼皂苷诱导的细胞凋亡是通过内质网应激介导的。

图2 Western blot检测凋亡相关基因Bcl－2和Bax的表达

图3 Western blot检测内质网应激相关基因GRP78和CHOP的表达

3 讨论

本研究发现重楼皂苷Ⅶ联合顺铂能有效抑制移植瘤生长，且没有任何副作用，提示重楼皂苷是一种具有抗肿瘤效应的中药成份。移植瘤细胞凋亡是通过内质网应激反应介导的，这也与我们体外实验相一致。颜［4］等发现重楼皂苷对10种肿瘤细胞株均有细胞毒作用，如人肺癌细胞A549、人乳腺癌细胞MCF－7、人结肠腺癌细胞HT29，人肾腺癌细胞A498等等，提示重楼皂苷具有广谱的抗肿瘤效应。重楼皂苷中活性成份较多，如重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ等。有研究表明重楼皂苷I在体外能阻滞人肝癌SMMC－7721细胞株的生长并诱导其凋亡，说明重楼皂苷其中的单一成份也能有效抑制肿瘤生长［5］。我们的研究则认为重楼皂苷Ⅶ是一种有效活性成份，在随后的研究中，我们将比较重楼皂苷各成份之间抗肿瘤效应的作用，确定最有效的成份。

目前研究表明，细胞凋亡和内质网应激有密切关系。内质网功能损伤则会引起内质网应激，内质网通过激活未折叠蛋白质反应（UPR）来保护这种细胞损伤，恢复细胞功能；但长期的内质网应激会诱导内质网相关性细胞凋亡，消除受损细胞，诱导内质网分子伴侣glucose－regulated protein78（GRP78）、转录因子growth arrest and DNA－damage－inducible gene 153（GADD153／CHOP）等内质网应激相关因子的表达［6－8］。我们有研究结果表明重楼皂苷处理移植瘤后，GRP78和CHOP的表达均明显上调，表明内质网应激反应正在进行。Bcl－2家族在内质网应激反应性凋亡中起着重要的作用，Bcl－2能够抑制内质网应激引起的细胞凋亡，而Bax的缺失可保护由内质网应激引起的细胞凋亡［9－11］。本研究结果也表明随着重楼皂苷Ⅶ浓度的增加，Bcl－2表达减少，而Bax蛋白表达增加，提示Bcl－2家族参与了内质网应激介导的细胞凋亡。本研究为临床上治疗卵巢癌提供了动物实验依据，有一定的临床意义。

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Inhibition of tumor growth in tumor－bearing mice by polyphyllins via endoplasmic reticulum stress

ZHANG Jia－ling，ZHENG Chang－jun，YANG Rui－qi，et al.（The Second Hospital of Jilin University，Changchun130041，China）

Objective To investigate the molecular mechanism of inhibiting of tumor growth in tumor－bearing mice by polyphyllinⅦand cisplatin.Methods SKOV3cells were inoculated subcutaneously into NOD／SCID mice，and the tumor－bearing mice were randomly divided into four groups（n＝10）：the control group，low－dose of polyphyllinⅦgroup（group LD），medium－dose of polyphyllinⅦgroup（group MD），high－dose of polyphyllinⅦgroup（group HD）.15days later，the tumor tissues were isolated and measured volume and weight to calculate the tumor inhibition rate；the tumor cell apoptosis and its mechanism were determined by TUNEL staining and Western blot.Results In group HD，the weight inhibition rate was 57.98%，volume inhibition rate was 55.11%，and the apoptotic rate was 42.39%，there was a significant difference compared with the control group.After treatment of polyphyllinⅦ，the expression of Bcl－2 was decreased and the expression of Bax was increased；the expression of GRP78and CHOP，the endoplasmic reticulum－related gene，was increased too.Conclusion The polyphyllins could effectively promote the apoptosis of tumor cells via endoplasmic reticulum stress.

PolyphyllinⅦ；xenografted tumor；apoptosis；endoplasmic reticulum stress

R285.5

A

2014－03－22）

1007－4287（2015）09－1450－04

中国博士后基金资助（2013M541316）；吉林省卫生厅科研课题（2013Z097）

＊通讯作者