抑制自噬增加PI3K／AKT／mTOR信号通路抑制剂引起的胃癌细胞死亡

斯庆图娜拉，刘 磊

（鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯017000）

抑制自噬增加PI3K／AKT／mTOR信号通路抑制剂引起的胃癌细胞死亡

斯庆图娜拉，刘 磊＊

（鄂尔多斯市中心医院，内蒙古鄂尔多斯017000）

目的 为了研究3－MA是否可能增强胃癌细胞对PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235的敏感性。方法 以胃癌SNU16细胞系为研究对象，SNU16细胞用不同浓度的NVP－BEZ235（10nM、20nM和50nM）处理24h。实验分为四组：Control组，20nM NVP－BEZ235组，5mM 3－MA组，20nM NVP－BEZ235联合5mM 3－MA组。MTT法用来检测不同组内细胞的生存率，Western blotting用来检测Cleaved Caspase－3和Cytochrome C的表达水平。结果MTT结果表明NVP－BEZ235能抑制SNU16细胞的增殖，3－MA增强了NVP－BEZ235对SNU16细胞的增殖抑制作用。Western blotting结果表明NVP－BEZ235增加了Cleaved Caspase－3和Cytochrome C的表达，而NVP－BEZ235联合3－MA会进一步诱导Cleaved Caspase－3和Cytochrome C蛋白的表达。结论 3－MA通过抑制自噬增加了SNU16细胞对NVP－BEZ235的敏感性。

胃癌；自噬；NVP－BEZ235；凋亡

（Chin J Lab Diagn，2015，19：1457）

尽管最近几年胃癌的发病率有所下降，但胃癌在我国恶性肿瘤中仍高居第一位。胃癌的发病原因主要与地域环境及日常生活饮食还有幽门螺杆菌感染有关。目前临床上治疗胃癌的主要手段是化学疗法和手术治疗［1－3］。而分子靶向治疗作为新颖的潜在的治疗癌症的手段之一，也在临床上得到了应用。已有实验研究表明PI3K／mTOR抑制剂NVPBEZ235能抑制胃癌野生型和突变型细胞的增殖并促进其凋亡［4］。肿瘤细胞的生长并非由单一的信号通路所支配，因此同时抑制几个作用靶点会产生更好的抑制细胞增殖效果［5］。因此本文探讨抑制自噬是否可以增加胃癌细胞对PI3K／mTOR抑制剂NVP－BEZ235的敏感性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂 人胃癌细胞株SNU16购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心；胎牛血清（美国HyClone公司）；胰蛋白酶和RPMI1640（美国Gibco公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT，美国Amresco公司）；二甲基亚砜DMSO（美国Amresco公司）；3－甲基腺嘌呤（3－methyl adenine，3－MA，德国CALBIOCHEM公司）；NVP－BEZ235（美国Sigma公司）；Cleaved Caspase－3和Cytochrome C抗体（美国proteintech公司）。主要实验仪器有CO2细胞培养箱（美国Cabinet公司），BioTek酶联免疫检测仪（Synergy HT公司），Western blot显像仪（日本Kodak公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养 人胃癌细胞株（SNU16）在含15%胎牛血清的RPMI1640培养基，37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中培养，3d换液传代1次。取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2细胞毒性试验检测 MTT法检测NVPBEZ235和（或）3－MA作用于胃癌SNU16细胞对其增殖的影响。取对数生长期SNU16细胞，以8000个／孔接种于96孔培养板，细胞贴壁后加药，按分组加入NVP－BEZ235或联合3－MA作用24h后弃上清，然后每孔加入20μl MTT（5mg／ml）溶液后继续培养4h，即可弃去孔板内的液体，再每孔加入150μl二甲基亚砜（DMSO），放于平板振荡器上振荡10min，酶标仪检测每孔光密度（OD）值（570nm波长）。每次实验重复3次，取平均值，按公式：细胞抑制率＝1－（药物组吸光度／对照组吸光度）× 100%，计算各组细胞存活率。

1.2.3Western Blotting检测 Western Blotting检测胃癌SNU16细胞中凋亡和线粒体途径凋亡相关蛋白的表达水平。①细胞总蛋白的提取：实验分组，将SNU16细胞接种于培养瓶中给药作用48小时后，用胰酶消化收集到离心管中，加入预冷的PBS（1ml），1000rpm／min，室温离心两次。取上清转移到1.5ml离心管中，混匀后，4℃，3 000rpm／min再次离心。倒净上清，每管加入200μl－300μl RIPA蛋白裂解液（含1%PMSF），超声5s左右打碎基因组后4℃放置45min（以上全程冰上操作）。之后用4℃、4 000rpm／min离心，取上清检测蛋白浓度，按体积比例加入一定量的5Xloading Buffer，98℃煮沸10min使蛋白变性，然后37℃放置10min冷却处理后存放在－20℃冰箱保存。②采用10%的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），通过半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭后结合一抗（Cleaved Caspase－3和Cytochrome C工作浓度为1∶1000），第二天加入对应的二抗（1∶1000稀释）室温孵育2h，洗膜3次，ECL显色液进行显影，以β－actin为内参照物。提取结果并用软件分析数据。

1.2.4统计学方法 采用SPSS17.0统计软件包进行数据处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示。两组均数比较用t检验，多组均数比较用单因素方差分析，采用析因设计的方差分析来检验联合效应。以P＜0.05为差异有统计学差异。

2　结果

2.1NVP－BEZ235可以引起胃癌SNU16细胞死亡

2.1.1MTT检测不同浓度NVP－BEZ235对SNU16细胞生存率的影响 Control，NVP－BEZ235（NVP）10nM，NVP－BEZ235（NVP）20nM，NVPBEZ235（NVP）50nM作用于SNU16细胞24h，结果可见不同浓度的NVP－BEZ235可明显地抑制SNU16细胞增殖，并呈现剂量依赖性（表1）。

表1　不同浓度NVP－BEZ235对SNU16细胞增殖率的影响

2.1.2Western Blotting检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase－3表达水平的影响 结果表明NVP－BEZ235能明显增加SNU16细胞内Cleaved Caspase－3的表达（图1）。

图1　不同浓度NVP－BEZ235对凋亡相关蛋白Cleaved Caspase－3表达的影响

2.1.3Western Blotting检测凋亡相关蛋白细胞色素C（Cytochrome C）表达水平的影响结果显示NVP－BEZ235可以明显的增加SNU16细胞内Cytochrome C表达（图2）。

图2　不同浓度NVP－BEZ235对Cytochrome C表达的影响

2.2联合应用自噬抑制剂3－MA可以明显增加NVP－BEZ235引起的人胶质瘤细胞SNU16细胞凋亡

2.2.1MTT检测联合应用3－MA（5mM）对SNU16细胞生存率的影响 实验分为Control组，3－MA（5mM）组，NVP－BEZ235（NVP，20nM）组，NVP－BEZ235联合3－MA（NVP＋3－MA）组，共四组。结果表明3－MA增强了NVP－BEZ235对SNU16细胞的增殖抑制作用（表2）。

表2　联合应用自噬抑制剂3－MA对SNU16细胞增殖率的影响

2.2.2Western Blotting检测凋亡相关蛋白Cleaved Caspase－3表达水平的影响 Western blotting实验结果表明Control组和3－MA组几乎不表达Cleaved Caspase－3；与NVP－BEZ235组相比，NVP－BEZ235联合3－MA组能进一步增加Cleaved Caspase－3的表达（图3）。

图3　联合应用3－MA对Cleaved Caspase－3表达的影响

2.2.3Western Blotting检测凋亡相关蛋白细胞色素C（Cytochrome C）表达水平的影响Western blotting实验结果表明Control组和3－MA组几乎不表达Cytochrome C；与NVP－BEZ235组相比，NVP－BEZ235联合3－MA组能进一步增加Cytochrome C的表达（图4）。

图4　联合应用3－MA对Cytochrome C表达的影响

3　讨论

磷脂酰肌醇3－激酶（PI3K）／蛋白激酶B（AKT）／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在肿瘤细胞中异常活性，包括胃癌［6］。PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110所组成。一旦PI3K被激活，p110可以使PIP2磷酸化转变为PIP3，进而通过3－磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1促使AKT的磷酸化。mTOR是PI3K／AKT的下游靶点，可以磷酸化S6核糖体蛋白和真核启动因子4E结合蛋白1，进而调控肿瘤细胞生长和增殖［7］。双重PI3K－mTOR抑制剂可以有效地抑制AKT的活性，因为传统的mTORC1抑制剂（比如雷帕霉素）可以导致PI3K信号通路的反馈激活，而双重抑制剂可以通过绑定这些激酶的ATP结合槽进而抑制PI3K和下游的mTOR激酶的活性，此外双重抑制剂还可以抑制AKT、S6核糖体蛋白和4E结合蛋白的活性。NVPBEZ235是一种新颖的双重PI3K－mTOR抑制剂，临床前期动物模型的试验表明NVP－BEZ235可以抑制肿瘤的增长，NVP－BEZ235在实体瘤中的治疗效果目前正在第1／2临床试验中进行评估［8，9］。在本实验中，我们验证了NVP－BEZ235能抑制胃癌细胞SNU16的增殖，并促进其凋亡。接下来，我们探讨抑制自噬是否更能促进NVP－BEZ235抑制增殖和促进凋亡的效果。

自噬是细胞在溶酶体内降解自身衰老、损伤的细胞器或蛋白并降解其内容物的过程。自噬在机体内环境稳定、细胞生长发育和蛋白质合成方面都发挥着重要的作用［10］。通过自噬降解的产物，细胞可以产生能量、生成新的蛋白质和细胞膜。在饥饿或应激状态下，自噬通过提供能量源或维持内环境稳态促进细胞存活。

自噬在癌症中具有双重作用：其一，自噬可以通过自噬性细胞死亡抑制肿瘤的发生；其二，自噬也可以通过为肿瘤细胞提供营养物质和防止刺激物对细胞的破坏维持肿瘤的生长。但以后者为主［11］。3－甲基腺嘌呤（3－MA）通过抑制Ⅰ型和Ⅲ型PI3K，阻断了自噬泡和溶酶体的融合，进而抑制了自噬［12］。在我们的研究中，抑制自噬增加了NVP－BEZ235对SNU16细胞的增殖抑制作用和促凋亡作用，同时进一步增加了Cleaved Caspase－3和Cytochrome C蛋白的表达。

总之，我们对胃癌的研究表明双重PI3K／mTOR抑制剂BEZ235和（或）联合自噬抑制剂3－ MA都可以诱导凋亡。BEZ235和3－MA联合使用会有更好的促进SNU16细胞凋亡的效果。因此，这些结果为临床上双重PI3K／mTOR抑制剂联合3－MA治疗胃癌提供了实验基础。

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The experimental research of 3－MA in the enhancement of sensitivity to PI3K／AKT／mTOR pathway inhibitor of gastric cancer in vitro

Siqingtunala，LIU Lei.（Erdos City Center Hospital，Erdos 017000，China）

Objective To study whether 3－MA can enhance the sensitivity of inhibitor NVP－BEZ235to gastric cancer cell.Methods SNU16cells were treated by different coneentrations of NVP－BEZ235（10nM，20nM and 50nM）for 24h.Next，SNU16cells were divided into four groups：Control group，20nM NVP－BEZ235group，5mM 3－MA group，20nM NVP－BEZ235combined with 5mM 3－MA group.MTT assay was used to examine the proliferation inhibition ofSNU16cells.Western blotting was used to detect a change in protein level of Cleaved Caspase－3and Cytochrome C.Results MTT assay showed that growth inhibition rates among the groups with different levels of NVP－BEZ235was statistically significant.NVP－BEZ235combined with 3－MA enhanced the inhibition ratio of cell compared with NVPBEZ235group.Western blotting showed that Cleaved Caspase－3and Cytochrome C were increased in cells following treated with NVP－BEZ235，and then 3－MA enhanced the expression of these proteins induced by NVP－BEZ235.Conclusion 3－MA sensitized SNU16cells to NVP－BEZ235by inhibition of auto－phagy.

gastric cancer；autophagy；NVP－BEZ235；apoptosis

R735.2

A

斯庆图娜拉（1979－），女，蒙古族，鄂尔多斯市中心医院，博士学历，研究方向：消化内科学。

2014－10－16）

1007－4287（2015）09－1457－04

＊通讯作者