‘鲁红一号’元宝枫叶片总RNA提取方法的比较研究

郝雪英等

摘要：‘鲁红一号元宝枫叶片中富含大量多糖、多酚物质，严重影响了总RNA提取的产率和质量。为了找出适宜‘鲁红一号元宝枫叶片总RNA提取的方法，本试验运用试剂盒法、TRIZOL法和改良CTAB法提取其秋季叶片总RNA。结果表明，试剂盒法提取的叶片总RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在1.8以上，但产率一般，有DNA污染；TRIZOL法提取的总RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在1.5左右，且产率最低；改良CTAB法提取的总RNA OD260/OD280、OD260/OD230均在2.0左右，且产率最高，电泳图较清晰。说明采用改良CTAB法提取的叶片总RNA质量和产率高，可以满足分子生物学进一步研究的需求，是‘鲁红一号元宝枫叶片总RNA提取的适宜方法。

关键词：‘鲁红一号元宝枫；总RNA提取；改良CTAB法

中图分类号：S792.35文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）03-0005-04

Comparative Study on Extraction Methods of Total RNA

from Leaves of Acer Truncatum ‘Luhong No. 1

Hao Xueying，Feng zhen，Lü Chuanqing

（College of Forestry，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China）

AbstractA large amount of polysaccharides and polyphenols in Acer truncatum ‘Luhong No. 1leaves have seriously affected the yield and quality of total RNA extraction.In order to obtain the appropriate method of total RNA extraction，3 methods，Kit method，TRIZOL and modified CTAB，were chosen to extract them from Acer truncatum ‘Luhong No. 1autumn leaves.The results showed that the total RNA extracted by Kit method had the general yield，the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both above 1.8，and had the pollution of DNA. That extracted by TRIZOL method had the lowest yield，the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both about 1.5. That extracted by modified CTAB method showed clear electrophoresis pattern and highest yield，and the ratios of OD260/OD280 and OD260/OD230 were both about 2.0.The results demonstrated that the yield and purity of the RNA obtained by the modified CTAB method could meet the demands of molecular biology experiment.The modified CTAB method was the appropriate method for total RNA extraction from Acer truncatum ‘Luhong No. 1 leaves.

Key wordsAcer truncatum ‘Luhong No. 1；Total RNA extraction；Modified CTAB method

元宝枫冠大荫浓、树姿优美、叶形美丽，在堤岸、湖边、草地及建筑附近配植皆很雅致，是北方重要的秋色叶树种。但在华北作庭荫树和行道树时，多数表现一般，本课题组经多年研究选育出的‘鲁红一号元宝枫，在拥有元宝枫观赏特性的基础上秋叶鲜红，红叶持续时间长，观赏价值高。

近几年来，关于元宝枫的研究报道较多，但内容偏向于植物生理、组织培养等方面[1～3]，有关其分子生物学的研究报道较少。从植物中提取纯度高、完整性好的总RNA是进行各项分子生物学研究的前提和基础，是研究基因转录、表达的重要环节。到目前为止，已有许多关于植物组织总RNA提取的研究报道[4～6]，最常用的有SDS-苯酚法[7]、改良SDS-苯酚法[8]、异硫氰酸胍法[9]、CTAB法[10]、改良热硼酸法[11]及各种试剂盒法等。因‘鲁红一号元宝枫为彩色叶树种，含有较多的多糖多酚物质，因而提取高纯度的RNA有一定难度，严重影响了元宝枫分子生物学研究。为此，本试验使用试剂盒法、TRIZOL法、改良CTAB法对‘鲁红一号元宝枫秋季叶片总RNA提取进行比较研究，通过检测分析获得了最佳提取方法，为深入开展元宝枫基因表达等分子生物学研究奠定基础，同时，为其他彩色叶树种的总RNA提取提供借鉴。

1材料与方法

1.1材料与试剂

叶片采自山东农业大学校园内栽植的‘鲁红一号元宝枫，植株长势健壮，秋叶鲜红，持续时间长。

试剂盒法采用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；TRIZOL试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；改良CTAB法所需药品均为本实验室配制。endprint

配制改良CTAB法试剂所需要的水均经过DEPC处理，玻璃仪器在烘箱里180℃烘10小时以上，塑料耗材先用DEPC水在37℃浸泡12小时以上，然后用灭菌锅灭菌。

1.2叶片总RNA的提取

1.2.1试剂盒法称取100 mg‘鲁红一号元宝枫秋季叶片，迅速放入盛有液氮的研钵中研磨至粉末状，按照试剂盒说明提取总RNA。

1.2.2TRIZOL法称取100 mg‘鲁红一号元宝枫秋季叶片，迅速放入盛有液氮的研钵中研磨至粉末状，按照试剂盒说明提取总RNA。

1.2.3改良CTAB法（1）称取100 mg‘鲁红一号元宝枫秋季叶片，迅速放入盛有液氮的研钵中研磨至粉末状，转入盛有1 000 μL 65℃预热的CTAB提取缓冲液[含2% CTAB、2% PVP、100 mmol/L Tris-HCl （pH 8.0）、25 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1.4 mol/L NaCl]的2 mL离心管内，离心管中提前加入20 μL β-巯基乙醇，充分颠倒混匀，65℃水浴40 min，每隔十分钟混匀一次，防止样品凝固于试管底部。

（2） 4℃、12 000 r/min离心25 min。

（3） 取上清于新的2 mL离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）充分混匀，4℃、12 000 r/min离心15 min。重复上述步骤。

（4） 取上清于新的1.5 mL离心管里，加入1/3体积的LiCl（8 mol/L）溶液，混匀，放入4℃冰箱过夜。

（5） 4℃、12 000 r/min离心30 min。

（6） 去掉上清液，分别用70%的乙醇和无水乙醇洗涤沉淀两次。

（7） 向沉淀中加入400 μL 65℃预热的SSTE充分溶解沉淀后，加入400 μL氯仿∶异戊醇（24∶1），充分混匀，4℃、12 000 r/min离心15 min。

（8） 取上清于新的1.5 mL离心管中，加入2倍体积的无水乙醇（-20℃放置）和1/10体积的NaAc（3 mol/L），充分混匀，于-80℃冰箱中放置30 min。

（9） 4℃、12 000 r/min离心30 min。

（10） 去掉上清液，用70%的乙醇和无水乙醇各洗涤沉淀两次。

（11） 将乙醇晾干，加入30 μL DEPC处理过的超纯水溶解沉淀，储存于-80℃冰箱中备用。

1.3RNA质量与浓度检测

取1 μL RNA样品，用ND-2000核酸蛋白分析仪进行含量以及纯度的测定。取5 μL RNA加1 μL 6×Loading Buffer，在1.0%琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液、10 V/cm稳压条件下电泳15 min，对RNA纯度和完整性进行检测[12]。

2结果与分析

2.1总RNA的质量与浓度

3种提取方法获得的‘鲁红一号元宝枫秋季叶片总RNA的纯度及产量结果见表l。

一般情况下，通过OD260/OD280检测RNA的纯度，高纯度的RNA OD260/OD280值应介于1.8～2.0之间，如果比值低于1.8表示含蛋白质、多糖、多酚物质较多，如果比值大于2.2，即表明RNA有降解。OD260/OD230值应大于2.0，过低则表明有盐离子污染[13]。由表1可知，试剂盒法产率较高；TRIZOL法产率最低，OD260/OD280比值为1.52，表明该方法不能有效去除总RNA中的蛋白质、多糖多酚物质，总RNA纯度很低；改良CTAB法纯度较高，OD260/OD280、OD260/OD230分别为1.98、2.07，并且产率也最高。

2.2总RNA样品的电泳检测

RNA样品的电泳检测是判断RNA质量的重要手段之一，从胶上18S和28S rRNA的完整性可判断RNA有无降解以及降解程度，同时可判断有无DNA、蛋白质污染。3种方法提取的总RNA经过1%琼脂糖凝胶电泳得到以下图片（图1），结果表明，试剂盒法和改良CTAB法提取的总RNA 18S和28S条带清晰，且28S亮度约是18S的两倍，但试剂盒法提取的总RNA有降解现象且有严重的DNA污染（图1A、1C）；TRIZOL法提取的总RNA 18S和28S条带不清晰，且亮度过弱，似有降解的迹象（图1B）。

3结论与讨论

高质量的RNA是分子生物学试验成功的最关键因素。许多研究表明，从植物的不同品种、不同器官及组织中提取高质量的RNA难度各不相同，这主要是与植物细胞中含有的一些成分有关，例如酚类物质、多糖、次级代谢产物以及RNase等。在大多数植物中，尤其是彩色叶植物，都含有大量多糖多酚物质。‘鲁红一号元宝枫与其他彩色叶植物相比，其植株体内的多糖、多酚类物质的含量较高，这两种物质的存在严重影响了RNA提取的质量与产率，因此有效地去除多糖多酚类物质是成功地提取高质量RNA的关键。

在植物细胞中，多糖和酚类物质与核酸在空间上是相互分离的，但对组织进行研磨破碎后，它们会与RNA相互作用，影响RNA的提取及后续反应[14]。多糖的多数理化性质与核糖核酸极其相似，很容易在去除多糖的同时降低RNA的产量；此外多糖可抑制酶的活性，被多糖污染了的RNA样品就无法用于进一步的分子生物学研究。而残留在样品中酚类物质随着氧化程度的增加颜色会变成深褐色，被氧化的酚类化合物能稳定地与RNA结合，导致RNA降解。

在前人研究的基础上，本试验运用改良CTAB法提取的元宝枫叶片总RNA质量最好，有效地抑制了叶片总RNA提取过程中多糖、多酚等代谢产物的干扰。其原因主要有：（1）较高浓度的CTAB不仅能对植物细胞有较好的裂解作用，而且能有效地分离核蛋白与核酸的复合物，同时和巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制RNase的活性；（2）CTAB提取缓冲液提前预热，有效缩短了植物材料水浴的时间，降低了RNA的降解概率；（3）CTAB提取缓冲液中加入PVP以及在提取过程中加入高浓度的NaCl能有效抑制酚类的氧化及未氧化的酚类，有力地防止多糖的污染；（4）试验过程中加入高浓度的LiCl可去除部分多糖。上述试剂增强了‘鲁红一号元宝枫植物组织的裂解能力，且为反应提供了有利的还原条件，抑制了多酚的氧化，去除多糖和蛋白的效果较好，并在试验过程中严格控制RNA酶对RNA的降解作用，因此该方法提取的总RNA产量与纯度与其他方法相比均较高，可用于后续的分子生物学研究。endprint

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