复发性流产与宫颈HPV感染的相关性分析*

钟小敏

复 发 性 流 产（Recurrent spontaneous abortions，RSA）是指与同一性伴侣连续发生2 次或2 次以上的自然流产[1-2]。其病因复杂，主要包括免疫、感染、遗传、环境、内分泌、血栓前状态等因素，部分患者原因不明[3]。流行病学资料显示RSA发生率约为15-40%，2次或2次以上的流产约占生育期妇女的2%~4%，而3次或3次以上的复发性流产约为1%~2%，且近年来伴随着生活习惯、饮食结构的不断变化，RSA的发病率逐年增加。近年研究表明，RSA约50%~60%与免疫紊乱有关，同时感染因素也占相当大比重，但由于各种病原体对胚胎毒性的作用不确切，故感染与RSA的关系最受争议[4]。目前国内外关于RSA与HPV感染的关系报道较少。卢银平等[5]对RSA孕妇流产组织的研究发现，人细小病毒B19感染可能与RSA发生密切相关。姚守珍等[6]对RSA病毒E-钙黏素及HPV相关性后发现RSA患者中E-钙黏素阳性率显著低于非RSA患者，HPV感染的阳性率显著高于RSA感染患者，其认为RSA与HPV感染有一定的相关性。为更好的探讨RSA与HPV感染的相关性，本文选取了较大样本的RSA患者与非RSA患者进行对照研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将本站妇科门诊就诊的早期复发性流产（RSA）98例患者作为实验组，排除标准：子宫畸形、宫内（细菌、真菌、原虫等）感染、内分泌及夫妇染色体异常，以及既往有自身免疫性疾病史；选取同时期妊娠的非RSA女性95例为对照组，入选标准为：诊断为早孕、非意愿正常妊娠要求终止妊娠，排除标准同RSA患者。RSA诊断标准为：与同一性伴侣连续遭遇2次或2次以上在20周妊娠前或胎儿丢失（体重≤500 g）。实验组患者年龄22~35岁，平均（28.9±4.7）岁，孕周5+2~12+4周，平均（7.1±3.6）周，孕次3~7次，流产2~6次。对照组患者年龄24~37岁，平均（29.2±5.1）岁，孕周4+6~12+2周，平均（6.9±3.7）周，孕次1~5次，流产0~4次。两组患者的年龄、孕周比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 实验室取材 观察组在确认胚胎停止发育，对照组于人工流产时进行取样，取样时采用棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分泌物，再用宫颈刷，在宫颈管内鳞柱上皮交界处采样，采样时稍用力转动数周，取得宫颈脱落细胞，放入有专用细胞保存液的试管中采集标本密闭，并在2 h内保存于4 ℃冰箱中，在48 h内进行下一步检查。

1.3 基因检测 采用导流杂交基因芯片技术，进行23种（18种高危型和5种低危型）HPV基因型的检测。主要步骤：（1）样本处理及HPV-DNA提取和富集：将选取的细胞样本加入预先配置的细胞消化液释放细胞DNA。（2）HPV-PCR扩增：选择HPVl基因区共有引物GP5+/GP6+和β-globin基因引物Glob-F/Glob-R对所有标本进行PCR 检测，后选用改进MY09/11共有引物（PGMY09/11）对所有β-Globin阳性而HPV阴性的标本进行二次扩增，检测HPV-611，16，18，30，31，33，35，45，51和52，采用目的基因的量/内参基因的量消除样本间的扩增效率差异，每管样本重复测量3次。PCR扩增程序设定，温度变化设定：95 ℃ 10 s， 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，75 ℃ 10 s，共进行40个循环，温度变化速率20 ℃/s。

1.4 观察指标 （1）比较两组人群的HPV各亚型分布情况；（2）将HPV16、HPV18作为HPV感染的高危组，HPV33、HPV58、HPV31作为低危组[7]，比较两组人群的高危及低危比例；（3）将HPV感染与RSA进行相关性分析。

1.5 统计学处理 数据处理采用SPSS 17.0统计学软件，计数资料采用百分率表示，采用 字2检验，相关性分析采用Spearman方法，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV感染情况 实验组中HPV阳性34例（34.7%），对照组HPV阳性12例（12.6%），实验组HPV阳性率显著高于对照组（ 字2=16.186，P<0.001）。实验组HPV阳性中HPV33、HPV58、HPV31、HPV18亚型所占例与对照组HPV阳性占各亚型比例比较差异均无统计学意义（P>0.05），HPV16亚型在实验组比例显著高于对照组（P<0.05）。见表1。

表1 两组人群HPV亚型的分布情况 例（%）

2.2 HPV低危与HPV高危感染情况 实验组中HPV高危比例显著高于对照组（P<0.001）。见表2。

表2 RSA感染的HPV低危与HPV高危的感染情况 例

2.3 HPV感染与RSA相关性分析 HPV阳性与RSA发生呈正相关性（r=0.259，P<0.001）。

3 讨论

复发性流产的治疗可谓医学界的一大“难题”，其病因复杂，部分患者病因不清。其中约50%~60%与免疫紊乱有关，同时感染因素也占相当大比重，但由于各种病原体对胚胎毒性的作用不确切，故感染与RSA的关系最受争议。HPV是目前已明确的与宫颈病变有关的病原体，最近报道，城市医院门诊患者HPV感染率高达21.82%，但仅少数转变为持续性感染，发展为CIN，甚至进展为浸润癌，在这一过程中，宿主的免疫反应对HPV感染的转归起着决定性作用。有关HPV感染与RSA的关系，国内仅1例报道HPV可能参与了复发性流产的过程，国外研究结果尚存争议。故对妊娠早期RSA女性HPV感染的发生率和基因型的分布与非RSA者进行比较分析，探讨HPV感染与RSA的关联性，对于RSA患者的诊断及预防提供新的方向，提升RSA患者的预后有重要的价值。

研究资料显示，HPV的主要易感因素为：性伴侣多且不固定、过早性生活、遗传、激素、生活环境等，其中宿主的免疫功能状况起着十分重要的作用。在年轻妇女中，HPV感染普遍存在，多可自然缓解，仅少数转变为持续性感染，发展为CIN，甚至进展为浸润癌[8]。王莉等[9]认为，宿主免疫反应对HPV感染的转归起着决定性作用。基于RSA和HPV感染均与免疫功能状态密切相关性，以及感染因素在RSA发生中所占的重要比重，RSA与HPV的可能相关性受到更多学者的关注。Hermonat等[10]首先发现，在自然流产组织中HPV感染率明显高于人工流产者，认为自然流产的发生可能与HPV感染有关。而Skoczyński等[11]报道，在RSA 的流产组织中与足月分娩胎盘中，HPV感染率并没有显著差异，但需要大样本研究进一步证实。Weyn等[12]发现了HPV存在于胎盘组织中的证据，认为HPV可以通过宫颈或受感染的精液而上行性感染，间接推测宫颈HPV感染者自然流产率可能高于非感染者。

本文的研究中采用的DNA分析方法为荧光定量PCR方法，其是指在PCR的反应体系中通过添加荧光，利用荧光信号积累实时的实现监测整个PCR的进程，目前临床上包含有2种荧光体系，其一为在反应中通过使用插入性荧光材料如，SYBR Green，加入该染料后，DNA模板可结合到双链DNA上并出现荧光，未结合的SYBR Green则不能发出荧光，另一种方法为使用荧光标记的寡核苷酸探针，通过探针结合到靶向序列上，通过探针与靶序列作用发出荧光。本研究即通过该种方法实现HPV分型诊断的目的。本文的研究中对RSA患者与非RSA患者的HPV感染情况进行基因检测后发现实验组中HPV阳性34例，占比34.7%，非RSA组HPV阳性12例，占比12.6%，实验组HPV阳性率显著高于对照组（ 字2=16.186，P<0.001）。提示RSA患者HPV的感染率显著高于非RSA患者，RSA的发生与HPV感染可能有密切关联。在对RSA与非RSA患者HPV感染各亚型占HPV感染阳性比例进行对比后发现，RSA患者的HPV阳性中各HPV33、HPV58、HPV31、HPV18例与非RSA患者HPV阳性占各亚型比例比较无统计学差异（P>0.05），HPV16亚型在RSA患者中比例显著高于非RSA患者（P<0.05），提示HPV16感染亚型可能为引发RSA的高危型。吴意等[13]在对HPV引发宫颈癌病理进行研究后发现，宫颈癌患者中HPV病变率高达18.29%，其中HPV16占比高达44.3%，且HPV16在低度宫颈鳞状上皮内病变（LSIL）、高度宫颈鳞状上皮内病变（HSIL）宫颈癌的检出率均为最高，依次为25.29%、57.14%、75.00%，提示HPV16感染可能在高危型子宫病变的发生及发展中起重要作用。目前关于HPV感染引发RSA的确切病理机制尚不明确，Boulenouar等[14]对HPV16 E5、E6、E7质粒转染体外培养的绒毛癌BeWo细胞证，HPV16可有效抑制BeWo、E-cadherin基因的表达。姚守珍等[6]研究发现，HPV1感染阳性的孕妇E-钙黏素阳性率研究组为35.71%，非RSA患者阳性表达率为100%，E-钙黏素的阳性表达被认为是妊娠期滋养细胞合成的重要物质，E-钙黏素表达抑制常引发流产[15]。本文的研究还发现HPV感染与RSA存在正相关性（r=0.259，P<0.001），但相关强度较低，分析原因可能与RSA发病的其他因素，如生活环境、不良生活习惯、遗传等因素有关。

总之，RSA与HPV感染关联密切，RSA患者中宫颈HPV感染比例显著高于非RSA患者，但关于RSA与HPV感染的确切关系有待于临床大样本、多中心对照研究及基础病理学进行深入探讨。

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